基于二硒化鉬納米球和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)靈敏檢測microRNA

夏 歡，謝星辰，黃克靖

(信陽師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，河南 信陽 464000)

0 引言

MicroRNA(miRNA)是在動植物體內(nèi)存在的一種內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，在生物生長發(fā)育、細(xì)胞的代謝、增殖和凋亡方面調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)并發(fā)揮了非常重要的作用[1,2]. 自1993年發(fā)現(xiàn)miRNA以來，大量證據(jù)表明miRNA參與了各種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程[3,4]. 因此，定量檢測人體異常表達(dá)的miRNA含量非常重要.

近年來，層狀過渡金屬硫族化物(如MoSe2、WS2、MoS2和VS2等)及其復(fù)合材料由于具有大的比表面積和好的導(dǎo)電性能吸引了人們的廣泛重視[5,6]. MoSe2是一種典型的層狀過渡金屬硫族化物，具有類似石墨烯的結(jié)構(gòu)，是由鉬金屬層夾在兩個硒層即由三個原子層(Se-Mo-Se)通過弱范德華力相互作用堆積而成. 該材料還具有較強(qiáng)的吸附能力、較高的反應(yīng)活性、較強(qiáng)的催化性能等優(yōu)點(diǎn)，因此，層狀MoSe2近來已被用于生物傳感器[7,8]、鋰電池等[9]以及超級電容器等領(lǐng)域[10,11]. 然而，由于其半導(dǎo)體的性質(zhì)，MoSe2的電子傳導(dǎo)能力仍相對較弱，且層狀的MoSe2納米材料由于其大的表面能而易于團(tuán)聚，影響了其應(yīng)用.

金納米粒子具有很好的導(dǎo)電性，能夠提高電子在電極表面的傳遞速率，并且金納米粒子還具有較高的催化效率、較大的比表面積以及良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn). 本研究以SiO2球?yàn)槟０澹疅岱ㄒ徊胶铣蒑oSe2納米片堆積成的納米球，并以此材料為電極基底，電沉積上AuNPs后，利用交聯(lián)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行信號放大，并結(jié)合過氧化物酶催化H2O2+HQ底液產(chǎn)生電化學(xué)信號高靈敏檢測microRNA-21.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器裝置

XK96-B快速混勻器,姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司；超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；掃描電子顯微鏡,SEM，SM-6480A，JEOL，日本；透射電子顯微鏡,TEM，JEM-2010，JEOL，日本；高壓反應(yīng)釜,SZ-97A，中國上海；TG16-WS臺式高速離心機(jī),中國湘儀. 電化學(xué)信號測量均在三電極系統(tǒng)中進(jìn)行，以鉑柱電極作為輔助電極，以Ag/AgCl為參比電極，將經(jīng)過修飾的玻碳電極(GCE)作為工作電極.

1.2 化學(xué)試劑

正硅酸乙酯(TEOS)、濃氨水、硒粉、鉬酸鈉、水合聯(lián)氨、對苯二酚、無水乙醇、氯化鉀、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、6-巰基-1-己醇(MCH)、30% 過氧化氫(H2O2)均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯金酸(0.1% HAuCl4)和辣根過氧化物酶(HRP)購自上海索萊寶生物科技有限公司. 實(shí)驗(yàn)所需的DNA、miRNA-21序列均由上海生物工程技術(shù)有限公司提供，其堿基序列如下.

捕獲探針：5’-SH-(CH2)6-TTTTTTTTTTT-TCAACATCAGT-3’

信號探針: 5’-Biotin-TCAACATCAGTCTG-ATAAGCTA-(CH2)3-3’MicroRNA: 5’-UAGCUUAUCAGACUGA-UGUUGA-3’

單堿基錯配：5’-UAGCUUAUCGGACUGA-UGUUGA-3’

三堿基錯配：5’-UUGCUUAUCGGACUGA-UCUUGA-3’

全錯配：5’-GUAAGGCAUCUGACCGAAG-GCA-3’DNA、miRNA-21序列所用的緩沖液如下：

改革開放以來，云南鐵路全面抓好客運(yùn)提速、裝備提質(zhì)和服務(wù)升級，將旅客列車增開至目前的181對，覆蓋全國26個省會中心城市和云南重點(diǎn)城市，基本淘汰老式“綠皮車”，客車旅行時速提升2.5倍。

TE 緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 7.4)用于配制和稀釋信號探針和捕獲探針；焦碳酸二乙酯的水溶液可用于稀釋和配制miRNA-21.

1.3 MoSe2 納米球的合成

首先制備SiO2納米球(圖1A)：取24.8 mL蒸餾水和90 mL濃氨水混合均勻得到溶液A；61.8 mL無水乙醇和4.5 mL TEOS混合均勻得到溶液B. 將B溶液滴加到A溶液中，常溫下劇烈攪拌2 h. 最后用蒸餾水和乙醇洗滌數(shù)次，離心收集，并在烘箱中60 ℃干燥12 h備用.

將0.05 g SiO2分散到含有20 mL蒸餾水和30 mL乙醇的溶液中，超聲30 min. 接著將0.21 g Na2MoO4·2H2O加到上述溶液中，超聲10 min. 然后加入預(yù)先用10 mL水合聯(lián)氨浸泡48 h的0.18 g硒粉的混合溶液. 最后，將上述混合溶液轉(zhuǎn)移至100 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯不銹鋼反應(yīng)釜中，在200 ℃反應(yīng)24 h. 冷卻至室溫后，將黑色沉淀物離心收集，用蒸餾水和乙醇洗滌數(shù)次，并在烘箱中60 ℃干燥12 h，得到MoSe2(圖1B).

圖1 SiO2納米球(A)和MoSe2(B)的掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of SiO2 nanosphere(A)and MoSe2(B)

1.4 生物傳感器的構(gòu)建

傳感器的構(gòu)建如圖2所示.

圖2 生物傳感器構(gòu)建示意圖Fig. 2 Schematic illustration for the construction of biosensor

首先稱取2 mg MoSe2超聲分散于2 mL水中(即質(zhì)量濃度為1 g/L)，再取8 mL該溶液滴在打磨好的電極表面，自然晾干備用. 然后將修飾電極置于0.1% HAuCl4溶液中于-0.2 V電沉積納米金40 s. 取8 mL 5.0×10-7mol/L巰基修飾的捕獲探針涂滴于電極表面，在室溫下反應(yīng)12 h，通過Au-S鍵將其固定在電極表面. 用PBS緩沖溶液沖洗掉電極表面過量的捕獲探針，再將5 mL 的MCH(1 mmol/L)滴涂于電極表面并室溫下放置30 min，用以除去電極表面非特異性吸附. 隨后，在電極表面滴加8 mL 不同濃度的miRNA-21，在37 ℃恒溫振蕩器中孵育60 min. 沖洗掉電極表面過量的信號探針，滴加8 mL 5.0×10-7mol/L的miRNA-21，在37 ℃恒溫振蕩器中雜交反應(yīng)80 min. 用PBS沖洗電極后，在其表面滴加6 mL HRP，于室溫下反應(yīng)40 min. 最后，將該電極在0.1 mol/L PBS (7.0) +1.8 mmol/L H2O2+2 mmol/L HQ的溶液中進(jìn)行電化學(xué)測量.

2 結(jié)果與討論

2.1 電化學(xué)性能測試

圖3 A是不同材料修飾電極在10 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-+0.1 mol/L KCl溶液中的CV曲線圖.

圖3 不同材料修飾電極上的CV圖Fig. 3 CV of various materials modified electrodes(a) GCE, (b) MoSe2/GCE, (c) AuNPs/MoSe2/GCE, (d) capture probe/AuNPs/MoSe2/GCE, (e) MCH/capture probe/AuNPs/MoSe2/GCE, (f) miRNA-21/MCH/capture probe/AuNPs/MoSe2/GCE, (g) signal probe/miRNA-21/MCH/capture probe/AuNPs/MoSe2/GCE, (h) Avidin HRP/signal probe/miRNA-21/MCH/capture probe/AuNPs/MoSe2/GCE

由圖3可知，在裸GCE上有一對良好的氧化還原峰(曲線a). 當(dāng)MoSe2修飾在電極表面時氧化還原峰電流沒有明顯的變化(曲線b)，這是因?yàn)镸oSe2是半導(dǎo)體材料，導(dǎo)電性能不是很好. 當(dāng)AuNPs進(jìn)一步修飾在電極表面時，氧化還原峰電流明顯增大(曲線c)，這是由于MoSe2大的比表面積和金納米顆粒良好的導(dǎo)電性的協(xié)同作用，促進(jìn)電子在電極表面的電子傳遞速率. 如圖3B所示，當(dāng)電極表面修飾上捕獲探針時，氧化還原峰電流顯著降低(曲線d)，這是由于捕獲探針帶負(fù)電荷，阻礙了電子在電極表面的傳遞. 隨后，當(dāng)MCH滴加到電極表面時，由于MCH的封閉作用，氧化還原峰電流繼續(xù)降低(曲線e). 當(dāng)目標(biāo)miRNA-21修飾到電極表面后，由于電極表面負(fù)電荷過多的聚集，所以氧化還原峰電流進(jìn)一步降低(曲線f). 當(dāng)電極表面修飾上信號探針時，氧化還原峰電流大大降低(曲線g)，這是由于DNA與目標(biāo)miRNA-21雜交， DNA鏈的延伸使電子轉(zhuǎn)移變得更加困難. 當(dāng)電極表面修飾上HRP時，由于HRP為生物大分子蛋白，阻礙了電子在電極表面的傳遞，所以氧化還原峰電流變得更小(曲線h). 這些CV結(jié)果說明了傳感器的成功制備.

2.2 MoSe2的信號放大作用

為了說明MoSe2納米球在生物傳感器中起了信號放大的作用，如圖4所示，測試了AuNPs/GCE(a)和AuNPs/MoSe2/GCE(b)在1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.1 mol/L KCl的PBS (7.0)溶液中的計時庫侖，得到了各自的Q-t曲線和Q-t1/2曲線. 由Anson公式：Q(t)=2nFAcD1/2t1/2/π1/2+Qdl+Qads計算各自的有效比表面積.

圖4 不同修飾電極的Q-t曲線(A)和Q-t1/2曲線(B)圖:(a) GCE，(b) Au/MoSe2/GCE；(C) 不同修飾電極的DPV曲線圖 :(a) HRP/signal probe/miRNA-21/MCH/capture probe/AuNPs/GCE,(b) HRP/signal probe/miRNA-21/MCH/captureprobe/AuNPs/MoSe2/GCEFig. 4 The Q-t (A) and Q-t1/2 (B) curves of different modified electrodes:(a) GCE,(b) Au/MoSe2/GCE; (C) The DPV curves of various electrodes:(a) HRP/signal probe/miRNA-21/MCH/capture probe/AuNPs/ GCE, (b) HRP/signal probe/miRNA-21/MCH/capture probe/AuNPs/MoSe2/GCE

由圖4 A和B可知，當(dāng)電極表面修飾MoSe2時，電極的有效比表面積明顯增大，能夠提供更多的結(jié)合位點(diǎn)來固定生物分子，從而提高生物傳感器的靈敏度.

還測試了修飾電極在0.1 mol/L PBS (含1.8 mmol/L H2O2+2 mmol/L HQ) 中DPV信號響應(yīng)，如圖4 C所示，a為HRP/signal probe/miRNA-21/MCH/capture probe/AuNPs/GCE， b為HRP/signal probe/miRNA-21/MCH/capture probe/AuNPs/MoSe2/GCE. 結(jié)果顯示，以MoSe2材料為基底的傳感器的DPV峰電流(曲線b)約為裸電極(曲線a)的2.1倍，這說明MoSe2在提高檢測信號方面起著重要作用.

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

為了獲得良好的分析性能，對實(shí)驗(yàn)中的幾個條件進(jìn)行了優(yōu)化. 圖5 A是對加金時間的優(yōu)化. 如圖所示，隨著沉積時間的增加，峰電流在10～40 s內(nèi)逐漸增大，40 s后峰電流有減小的趨勢，這是由于電極表面修飾了過多的金納米顆粒，從而降低了電極表面的活性位點(diǎn). 因此,電沉積金最佳時間為40 s. 圖5B是對miRNA-21孵育時間的優(yōu)化. 如圖所示，峰電流在20～60 min內(nèi)隨著孵育時間的增加逐漸增加，超過60 min后峰電流逐漸減小，表明miRNA-21雜交反應(yīng)時間至少是60 min. 為了節(jié)約時間，miRNA-21孵育最佳時間為60 min. 圖5C是對Signal probe孵育時間的優(yōu)化. 峰電流在20～80 min內(nèi)隨著孵育時間的增加逐漸增加，超過80 min后峰電流逐漸減小，表明Signal probe雜交反應(yīng)最佳時間為80 min. 圖5 D是對HRP孵育時間的優(yōu)化. 如圖所示，反應(yīng)時間在10～30 min之間峰電流逐漸增加，直到反應(yīng)時間為40 min時峰電流幾乎保持穩(wěn)定，這表明雜HRP與生物素的結(jié)合已經(jīng)完成. 所以HRP的最佳孵育時間為40 min.

圖5 不同實(shí)驗(yàn)條件的影響: (A) 電沉積金時間; (B) microRNA-21孵育時間; (C) 信號探針孵育時間; (D) HRP孵育時間Fig. 5 The effect of various conditions: (A) electro-deposition timeof AuNPs; (B) Incubation time of microRNA-21;(C)Incubationtime of signal probe; (D)Incubation time of HRP

2.4 傳感器的線性范圍和檢出限

在優(yōu)化條件下，測定了修飾不同濃度的miRNA-21后的DPV信號響應(yīng). 如圖6所示，曲線a為空白溶液的DPV曲線.當(dāng)修飾不同濃度的miRNA-21后，DPV信號隨miRNA-21的濃度的增加而增大，并且miRNA-21濃度的負(fù)對數(shù)與峰電流的大小呈良好的線性關(guān)系，其線性方程為：

I(μA) = -69.7-4.36 lgc(c，mol/L).

相關(guān)性系數(shù)R=0.996，線性范圍為1×10-16～1×10-10mol/L，檢出限為0.16 fmol/L.

圖6 不同濃度miRNA-21的DPV曲線從a到h，濃度依次為0，1×10-16，1×10-15，1×10-14，1×10-13，1×10-12，1×10-11，1×10-10 mol/L，插圖為濃度的負(fù)對數(shù)與DPV峰電流的線性關(guān)系Fig. 6 The DPV curves of various concentrations of miRNA-21from a to h,0，1×10-16，1×10-15，1×10-14，1×10-13，1×10-12，1×10-11，1×10-10 mol/L.Inset is calibration plot of the DPV currents versusthe negatively logarithm of miRNA-21 concentrations

2.5 生物傳感器的特異性和重現(xiàn)性

選擇性是電化學(xué)生物傳感器性能的重要指標(biāo). 如圖7所示，在相同條件下，通過對比它們在10 mL 0.1 mol/L PBS(7.0)+1.8 mmol/L H2O2+2 mmol/L HQ溶液中的DPV峰電流值，可以發(fā)現(xiàn)，堿基完全互補(bǔ)序列的峰電流最高，堿基完全錯配序列、三個堿基錯配和單堿基錯配序列的峰電流均比較低，表明該傳感器具有良好的選擇性，可用于特異性檢測miRNA-21. 利用批內(nèi)檢測和批間檢測考察了傳感器的重現(xiàn)性. 同一批次6個生物傳感器對1.0 × 10-14mol/L miRNA-21的DPV響應(yīng)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.9%，不同批次6個生物傳感器對1.0 × 10-14mol/L miRNA-21的DPV響應(yīng)的RSD為7.3%.

圖7 不同DNA的DPV響應(yīng)信號比較(a) miRNA-21；(b) 一個堿基錯配miRNA序列；(c)三個堿基錯配miRNA序列；(d) 堿基完全錯配miRNA序列Fig. 7 The effect of various conditions(a)miRNA-21; (b)single-based mismatch sequence;(c) three-based mismatch sequence;(d)non-complementary sequence

2.6 實(shí)際樣品分析

將傳感器用于人血清樣品(取自校醫(yī)院)的測定(如表1).采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，每個樣品測定3次，結(jié)果見表1.

表1 血清樣品的測定結(jié)果Tab. 1 Analytical results of serum sample (n = 3)

由表1可知，RSD為3.5%～5.3%，回收率在97.3%～103.6%之間. 這些結(jié)果表明所建立方法具有較好的準(zhǔn)確性，可用于實(shí)際樣品分析.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將MoSe2納米球、金納米和交聯(lián)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合起來，構(gòu)建了miRNA-21高靈敏檢測新方法，并以HRP催化H2O2+HQ的體系產(chǎn)生檢測信號放大進(jìn)一步提高檢測靈敏度. 所建立方法還具有好的選擇性和重現(xiàn)性，可望為癌癥等重大疾病的早期診斷、臨床治療和藥物篩選等提供簡便實(shí)用的新方法.