一個(gè)LIG4綜合征家系基因突變分析和產(chǎn)前診斷

張?chǎng)嘻?沈國(guó)松 李雯雯 陽(yáng)鑫妙

嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷?。╯evere combined immunodeficiency，SCID）是一組有不同基因異常所致的嚴(yán)重T細(xì)胞缺乏或功能異常，并伴隨B淋巴細(xì)胞功能異常的疾病[1]。SCID是一類比較多見(jiàn)的原發(fā)性免疫缺陷病，新生兒的發(fā)病率為1/75 000～1/100 000[2]。目前發(fā)現(xiàn)的SCID相關(guān)基因有 13 個(gè)，包括 IL-2RG、ADA、JAK3、RAG1、RAG2、IL-TRa、DCLRE1C、LIG4、DNA-PKcs、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD45[3]。其中LIG4基因突變引起的SCID稱為L(zhǎng)IG4綜合征，這是一種非常罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病，患兒常表現(xiàn)為發(fā)育異常和腫瘤傾向[4]。LIG4綜合征是嚴(yán)重的致死性遺傳病，藥物治療效果差，早期基因診斷行免疫重建是治療和延長(zhǎng)已出生患兒生存期的最好辦法。但是，預(yù)防患兒出生是最終目標(biāo)。因此，本研究通過(guò)應(yīng)用芯片捕獲后行高通量測(cè)序法檢出先證者的基因突變，成功對(duì)其母親再次妊娠進(jìn)行產(chǎn)前診斷，有效避免患兒的出生；現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 先證者女，足月順產(chǎn)出生，頭圍偏小，體重偏輕。1歲時(shí)因接種疫苗后開(kāi)始持續(xù)有中耳炎、腹瀉、巨細(xì)胞病毒感染，血常規(guī)檢查提示全血細(xì)胞減少，對(duì)抗生素和免疫球蛋白的治療效果差，一直轉(zhuǎn)輾于本院與外院治療。當(dāng)時(shí)先證者及其父母均抽取外周血作基因檢測(cè)。先證者3歲時(shí)因顱內(nèi)腫瘤死亡。父母表型正?！，F(xiàn)母親再次懷孕（高齡并孕20周），為避免再次分娩LIG4綜合征患兒，2016年11月8日來(lái)本院作產(chǎn)前診斷。

1.2 目標(biāo)序列捕獲 抽取先證者及其父母外周靜脈血5ml，標(biāo)準(zhǔn)流程提取基因組DNA（QIAamp DNA Blood Midi Kit，德國(guó)Qiagen）。質(zhì)檢合格的基因組DNA使用Covaris LE220超聲波儀（美國(guó)Massachusetts）進(jìn)行隨機(jī)打斷，產(chǎn)生200～250bp的隨機(jī)片段。隨后進(jìn)行Ampure Beads純化，將純化后的DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)、加“A”以及加接頭反應(yīng)，再經(jīng)過(guò)連接介導(dǎo)PCR（ligationmediated PCR，LM-PCR）進(jìn)行擴(kuò)增和純化。利用定制的1445號(hào)基因片段捕獲芯片（Roche Nimble Gen，美國(guó)Madison）與20個(gè)標(biāo)記好的患者DNA庫(kù)47℃雜交64～72h，通過(guò)芯片雜交捕獲下來(lái)的DNA片段用鏈霉親和素磁珠富集，被捕獲的片段使用LM-PCR生成測(cè)序用的DNA庫(kù)。

1.3 序列分析 首先對(duì)生成的測(cè)序DNA庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢，去除低質(zhì)量以及被接頭污染的測(cè)序序列。合格的DNA庫(kù)與Illumina測(cè)序原件上的互補(bǔ)接頭進(jìn)行雜交，然后使用高保真的DNA聚合酶對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，在HiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序深度＞100X，測(cè)序數(shù)據(jù)分析采用Illumina分析流程。使用Illumina basecalling 1.7軟件進(jìn)行原始圖像數(shù)據(jù)處理。每條測(cè)序序列產(chǎn)生90bp的雙向測(cè)序讀長(zhǎng)。

1.4 Sanger法驗(yàn)證 對(duì)所有發(fā)現(xiàn)的致病突變，在其所在片段上下游設(shè)計(jì)引物。行PCR擴(kuò)增，對(duì)產(chǎn)物作Sanger測(cè)序，所得結(jié)果與LIG4基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，從而驗(yàn)證基因芯片捕獲和高通量測(cè)序的結(jié)果。

1.5 羊水母血污染鑒定和產(chǎn)前診斷 對(duì)先證者母親在超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹行羊膜腔穿刺術(shù)抽取羊水20ml，其中10ml按標(biāo)準(zhǔn)流程提取基因組DNA后，選用16HS System試劑盒（Promega Corporation，美國(guó)Madison）、ABI3130XL遺傳分析儀，與父母DNA進(jìn)行個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。確定無(wú)母源污染后，再對(duì)羊水DNA的LIG4基因作針對(duì)性的Sanger法驗(yàn)證；另外10ml羊水用于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)、制片及G顯帶核型分析。

2 結(jié)果

2.1 LIG4基因突變的確定 高通量測(cè)序顯示先證者攜帶LIG4基因的復(fù)合雜合突變，位點(diǎn)為c.833G＞C（p.A278L），1271-1275del（p.K424fs），見(jiàn)圖1。其中父親攜帶c.833G＞C（p.A278L），是錯(cuò)義突變；母親攜帶1271-1275del（p.K424fs），是框移突變。2個(gè)位點(diǎn)為已證實(shí)的突變，故本研究未在健康群體中驗(yàn)證。

圖1 先證者LIG4基因測(cè)序圖

2.2 胎兒的產(chǎn)前診斷 羊水DNA的LIG4基因經(jīng)過(guò)Sanger驗(yàn)證，顯示胎兒攜帶與先證者相同的LIG4基因突變位點(diǎn)，即 c.833G＞C（p.A278L），1271-1275del（p.K424fs）。胎兒的羊水染色體核型為46，XX。

2.3 遺傳咨詢 本院產(chǎn)前診斷中心告知該胎兒出生后將發(fā)展為L(zhǎng)IG4綜合征患者，家屬選擇終止妊娠。

3 討論

LIG4綜合征是一種DNA雙鏈斷裂后非同源末端鏈接（non-homologous end joining，NHEJ）通路缺陷病，為罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病，在2011版原發(fā)性免疫缺陷病分類中被歸為聯(lián)合免疫缺陷病[5]。其臨床表現(xiàn)為輻射敏感，小頭畸形，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，聯(lián)合免疫缺陷、自身免疫性疾病和腫瘤等。LIG4綜合征的發(fā)病機(jī)制是LIG4基因異常。LIG4即DNA連接酶4，是NHEJ的核心組分之一，基因位于13q33-34。含有1個(gè)氨基端催化域和2個(gè)羧基端乳腺癌易感蛋白的LC末端結(jié)構(gòu)域。LIG4和XRCC4通常以復(fù)合體的形式存在，主要參與DNA斷鏈末端的對(duì)比和缺口填補(bǔ)，還能與DNA斷鏈末端的DNA-Pkcs、Ku蛋白相互作用，促進(jìn)DNA斷鏈的連接。LIG4在復(fù)制和V（D）J重排過(guò)程中起著重要作用。因此，當(dāng)LIG4缺陷時(shí)，若細(xì)胞出現(xiàn)損傷會(huì)因無(wú)法正常修復(fù)而死亡；或在發(fā)生免疫反應(yīng)時(shí)，T、B淋巴細(xì)胞因受體重排障礙而失去免疫功能，從而導(dǎo)致聯(lián)合免疫缺陷[6]。

Buck等[7]報(bào)道15例LIG4缺陷的患者中，有6例出現(xiàn)血液惡性腫瘤，2例為前T細(xì)胞白血病和（或）淋巴瘤，1例骨髓發(fā)育不良，4例出現(xiàn)B細(xì)胞增殖性疾病。而本例患兒的臨床表現(xiàn)與上述報(bào)道相符，其LIG4的基因測(cè)序顯示為1271-1275del（p.K424fs）的復(fù)合雜合突變。其中c.833G＞C（p.Arg278Leu）導(dǎo)致LIG4蛋白氨基酸（aa）序列第278位點(diǎn)發(fā)生密碼子改變：由精氨酸變?yōu)榱涟彼?；該aa位點(diǎn)位于活化中心周圍的一個(gè)高度保守基因序列，其改變將導(dǎo)致LIG4功能明顯受損[7]。已有該位點(diǎn)致病性的相關(guān)報(bào)道，Jiang等[8]同時(shí)用Sift和Polyphen軟件對(duì)其蛋白功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，也認(rèn)為對(duì)LIG4蛋白功能有害，該位點(diǎn)人群發(fā)生率極低。而1271-1275del（p.K424fs）的框移突變是已知的致病突變，它能使編碼蛋白序列提前終止，產(chǎn)生截短蛋白或被降解，早期終止密碼子啟動(dòng)無(wú)義突變介導(dǎo)的mRNA降解，大大降低mRNA表達(dá)及LIG4蛋白表達(dá)，該位點(diǎn)人群發(fā)生率也極低。由于LIG4綜合征是一種常染色體隱性遺傳病，患兒的父母為1個(gè)突變位點(diǎn)的攜帶者，未見(jiàn)發(fā)??；患兒為同一基因的復(fù)合雜合突變，對(duì)LIG4蛋白功能的影響大，使得患兒發(fā)病。LIG4綜合征的患兒發(fā)病早、病情較重、早期致死，因此早期診斷并行造血干細(xì)胞移植是目前最有效的治療手段。國(guó)外已報(bào)道1例LIG4基因復(fù)合雜合突變（q1+H282L+R581fs）的患者免疫重建成功[9]。但是，移植成功率低、移植后并發(fā)癥多、醫(yī)療費(fèi)用昂貴等限制了其臨床應(yīng)用。因此，避免患兒出生是產(chǎn)前診斷的根本目標(biāo)。該家族父母再次生育LIG4綜合征患兒的概率為1/4，且胎兒期患兒無(wú)典型的外觀異常，無(wú)法用影像學(xué)檢查來(lái)診斷，只能依靠基因測(cè)序。因此，本中心在患兒母親再次妊娠時(shí)，根據(jù)孕婦年齡、孕周行羊膜腔穿刺術(shù)抽取胎兒羊水細(xì)胞，一部分進(jìn)行胎兒核型分析；同時(shí)排除母源污染后用Singer法檢測(cè)胎兒的LIG4基因，驗(yàn)證胎兒攜帶與先證者相同的致病突變，告知家屬其出生后將發(fā)展成LIG4綜合征患者，家屬最終選擇終止妊娠。此外，本中心已指導(dǎo)該夫妻想要生育健康的胎兒，可行三代試管嬰兒，即胚胎植入前產(chǎn)前診斷，防止該遺傳病的傳遞。

綜上所述，本研究采用目標(biāo)序列芯片捕獲SCID發(fā)病相關(guān)基因，再通過(guò)高通量測(cè)序進(jìn)行LIG4基因突變檢測(cè)。芯片捕獲高通量測(cè)序技術(shù)是新一代的測(cè)序技術(shù)，相較于傳統(tǒng)單基因病成本高、適用疾病少、普及面低、通量低的檢測(cè)方法，它能在較短時(shí)間內(nèi)同時(shí)對(duì)幾十萬(wàn)甚至幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列分析，因此更適用于對(duì)單基因病隱性遺傳病攜帶者的篩查與產(chǎn)前診斷[10]。本次研究完成了1個(gè)LIG4綜合征家系的基因突變鑒定和再次妊娠的產(chǎn)前診斷，避免了高危胎兒的出生。