江蘇省鹽城市3株白羽肉鴨源鵝細(xì)小病毒的分離鑒定及其VP3基因遺傳進(jìn)化分析

李亞非，潘金金，陳洪益，陸紅霞，劉 東，劉紅祥，陳先亮，徐全剛

（1. 江蘇省鹽城市亭湖區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇鹽城 224001；2. 青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266011；3. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

2013年開始，我國(guó)山東、安徽等地的白羽肉鴨暴發(fā)了一種以長(zhǎng)舌、短喙、生長(zhǎng)抑制，屠宰時(shí)易斷腿、斷翅為主要特征的疫病，俗稱“鴨大舌病”。此病最早于1971年在法國(guó)半番鴨中發(fā)現(xiàn)。Palya等[1]2009年對(duì)病原進(jìn)行分離和鑒定，確定為變異鵝細(xì)小病毒或稱變異小鵝瘟病毒（Goose parvovirus，GPV）。該病毒與經(jīng)典小鵝瘟病毒有所差異，引起的疾病被命名為短小與侏儒綜合征（Short beak and dwarfism syndrome，SBDS）。2014年以后，國(guó)內(nèi)多位專家研究證明，導(dǎo)致我國(guó)白羽肉鴨發(fā)生SBDS的病原也是GPV[2-6]。GPV主要感染白羽肉鴨，且傳播迅速。該病的發(fā)病日齡越小，死淘率越高，15日齡后發(fā)病的鴨生長(zhǎng)抑制，易出現(xiàn)斷毛、掉毛、斷腿、斷翅、飼料報(bào)酬率高等現(xiàn)象。目前該病已在全國(guó)白羽肉鴨養(yǎng)殖地區(qū)廣泛傳播，造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。江蘇省徐州市一直是該病的高發(fā)區(qū)，而在其他地區(qū)則鮮有報(bào)道。2017年江蘇省鹽城市報(bào)道出現(xiàn)此病，經(jīng)臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷，確診為SBDS。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集與處理 樣品來(lái)源于江蘇省鹽城市多個(gè)發(fā)病肉鴨場(chǎng)。發(fā)病鴨日齡集中于10日齡左右，主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)抑制、矮小、短喙，舌頭伸出喙外無(wú)法收縮，部分鴨腹瀉、癱瘓，發(fā)病率為30%～50%。采集發(fā)病鴨的胰腺、肝臟、脾臟、腎臟等組織樣品，加入適量抗生素PBS液，經(jīng)剪切勻漿后反復(fù)凍融3次，取上清經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 DNA提取試劑盒：購(gòu)自Axygen公 司；RNA 提 取 試 劑TRIzol Reagent： 購(gòu) 自Invitrogen公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶及Taq DNA聚合酶：購(gòu)自Fermentas公司；RNA酶抑制劑（RNasin）：購(gòu)自大連Takara公司；pGEM-T easy載體：購(gòu)自 Promega公司；DNA Gel Extraction Kit：購(gòu)自Axygen公司。

1.1.3 引物 利用Chang等[7]報(bào)道的引物進(jìn)行水禽細(xì)小病毒鑒定，用Zàdori等[8]發(fā)表的水禽細(xì)小病毒病VP3基因保守區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由上海華大生物技術(shù)有限公司合成。

表1 水禽細(xì)小病毒引物

1.1.4 非免疫鴨胚 非免疫鴨胚購(gòu)自江蘇泰興某種鴨場(chǎng)，經(jīng)乳膠凝集方法[9]檢測(cè)，卵黃中鵝細(xì)小病毒抗體陰性。

1.2 方法

1.2.1 組織樣品PCR檢測(cè) 將1.1.1中處理好的病料上清，用Axygen公司提供的方法提取樣品總DNA，并按TRIzol Reagent法提取總RNA。用表1中GPV-F/R引物檢測(cè)小鵝瘟病毒（GPV），同時(shí)分別用禽流感病毒（AIV）[10]、新城疫病毒（NDV）[11]、坦布蘇病毒（DTV）[12]、鴨肝炎I型病毒（DHV1）[13]和鴨肝炎III型（DHV3）[14]病毒及呼腸孤病毒（ARV）[15]等引物，按照文獻(xiàn)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增AIV使用12堿基隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄第一鏈，其他均使用6堿基隨機(jī)引物）。

1.2.2 病毒分離與純化 取病料上清0.2 mL經(jīng)尿囊腔接種11日齡鴨胚，每份接種3個(gè)胚，收集24 h后死亡和有鴨胚體病變的鴨胚尿囊液，盲傳4代。

1.2.3VP3保守基因PCR擴(kuò)增、克隆及序列測(cè)定 取備用尿囊液提取總DNA，用VP3-F/R引物PCR 擴(kuò)增。條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，53 ℃35 s，72 ℃ 1 min 50 s，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物電泳后切膠純化回收，克隆到pGEM-T easy載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；采用SDS堿裂解法小量提取質(zhì)粒，陽(yáng)性質(zhì)粒送南京金斯瑞生物科技有限公司，在ABI PRISMTM3730型DNA測(cè)序儀上進(jìn)行序列測(cè)定。應(yīng)用Lasergene 7.1軟件，對(duì)測(cè)序基因片段進(jìn)行拼接，利用GenBank中的BLAST工具，查找基因序列的同源序列，應(yīng)用MEGA 6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)和遺傳進(jìn)化樹繪制。

2 結(jié)果

2.1 組織樣品PCR檢測(cè)

3個(gè)場(chǎng)樣品的PCR檢測(cè)中，只有GPV引物組為陽(yáng)性，其他各病毒引物均未能擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶（圖1）。

2.2 病毒分離

病料經(jīng)尿囊腔接種鴨胚后，發(fā)現(xiàn)鴨胚盲傳前3代的平均死亡率為55%，第4代鴨胚死亡率明顯增加，為89%；收取第4代尿囊液，提取尿囊液總DNA，用VP3-F/R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)3份尿囊液PCR結(jié)果都為陽(yáng)性（圖2）。

圖2 VP3基因PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3 VP3保守基因序列比對(duì)分析

將2.2中PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的條帶克隆至T載體后測(cè)序。利用所測(cè)序列，通過(guò)BLAST軟件下載同源性相似的參考序列，并截取參考序列VP3基因，用MEGA 6.0軟件進(jìn)行基因進(jìn)化分析。通過(guò)序列比對(duì)可以看出，此次分離的3株鴨源GPV（YC1、SQ1、SQ2）間的VP3基因核苷酸同源性為100%；與我國(guó)其他地區(qū)鴨源GPV代表株（DS15、JS1等）同源性也很高，達(dá)99.6%以上；與番鴨源GPV代表株（D、PT等）同源性為95%～99%。值得一提的是，此次分離株盡管與經(jīng)典小鵝瘟代表株（B、GER、YZ99、GDa等）同源性都在95%以上，但從進(jìn)化圖譜看，分離株與西歐經(jīng)典小鵝瘟株親緣關(guān)系更近（圖3），而引起番鴨SBDS的毒株則與我國(guó)小鵝瘟分離株親緣關(guān)系更近；分離株與番鴨細(xì)小病毒代表株P(guān)株等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，只有81%～83%。

圖3 基于水禽細(xì)小病毒VP3基因遺傳進(jìn)化樹

3 討論

水禽細(xì)小病毒種類繁多，宿主范圍廣，按細(xì)小病毒VP3基因的遺傳學(xué)分類，可分為小鵝瘟病毒、番鴨細(xì)小病毒（番鴨“三周病”）、番鴨小鵝瘟病毒等。其中，小鵝瘟病毒主要引起雛鵝出血、栓塞性腸炎，番鴨細(xì)小病毒主要引起3周齡內(nèi)番鴨氣喘、拉稀。番鴨小鵝瘟病毒從遺傳學(xué)上分析屬于小鵝瘟中國(guó)株和番鴨細(xì)小病毒的重組變異病毒，主要引起番鴨短喙矮小綜合征和腸炎。2013年以后，我國(guó)養(yǎng)殖白羽肉鴨陸續(xù)出現(xiàn)小鵝瘟病毒感染，并且與番鴨感染小鵝瘟后的癥狀類似。最初，學(xué)者們都認(rèn)為經(jīng)典小鵝瘟病毒不會(huì)引起北京鴨（櫻桃谷鴨）、白鴨發(fā)病，但Ning等[16]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典小鵝瘟病毒經(jīng)人工途徑感染北京鴨（櫻桃谷鴨）后，也會(huì)造成鴨生長(zhǎng)緩慢、短喙等現(xiàn)象，但較鴨源小鵝瘟分離株引起的臨床癥狀要輕微很多。值得重視的是，本研究通過(guò)遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，這3株引起SBDS毒株的VP3基因與小鵝瘟歐洲經(jīng)典株同源性更高。而我國(guó)櫻桃谷鴨的種源長(zhǎng)期依賴進(jìn)口，提示這3株病毒可能通過(guò)引種傳入我國(guó)，或者由歐洲分離株進(jìn)化而來(lái)。這一發(fā)現(xiàn)給我國(guó)肉鴨的引種帶來(lái)了新的啟示。

此研究首次報(bào)道江蘇省鹽城市鴨源小鵝瘟病毒引起白羽肉鴨SBDS。鹽城市水系發(fā)達(dá)，一直有飼養(yǎng)水禽、消費(fèi)水禽的習(xí)慣。而這3株病毒分離于自然水域飼養(yǎng)的櫻桃谷鴨，且都與蛋鴨、白鵝一起混養(yǎng)。這種飼養(yǎng)模式極易造成該病在不同種群間的擴(kuò)散傳播，因此開展該病的持續(xù)監(jiān)測(cè)對(duì)于了解該病的分布及病原變異情況具有重要意義。該病病原為新型水禽細(xì)小病毒，目前尚無(wú)有效的預(yù)防及治療方法。但因其病原屬于水禽細(xì)小病毒，因此臨床上經(jīng)常使用小鵝瘟抗體來(lái)預(yù)防和治療該病。但在此需要特別強(qiáng)調(diào)的是，雖然抗體的早期使用能抑制臨床上出現(xiàn)的短喙、侏儒等明顯發(fā)病現(xiàn)象，但仍然不能解決鴨生長(zhǎng)后期出現(xiàn)的飼料報(bào)酬率低，體重偏輕，屠宰時(shí)斷腿、斷翅等問(wèn)題。因此，研發(fā)高質(zhì)量的亞單位疫苗、基因工程疫苗、抗原抗體復(fù)合物疫苗是解決該問(wèn)題而更值得關(guān)注的研究方向。

4 結(jié)論

通過(guò)PCR 檢測(cè)、基因測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析，確定2017年江蘇省鹽城市部分櫻桃谷鴨發(fā)生短小與侏儒綜合征的病原為一種新型鵝細(xì)小病毒。該毒株與歐洲分離株的親緣關(guān)系更近，提示病毒可能通過(guò)引種傳入我國(guó)，或者由歐洲分離株進(jìn)化而來(lái)。今后將圍繞該病開展詳細(xì)的流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)，繼續(xù)追溯和追蹤病毒的來(lái)源和變異情況，以便為該病防控提供強(qiáng)有力的支持。