基于生物質(zhì)譜技術(shù)解析食源性糖蛋白糖基化位點(diǎn)的研究進(jìn)展

趙文竹,薛思宇,陳月皎,張宏玲,于志鵬,勵(lì)建榮,*,劉靜波

(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121013;2.吉林大學(xué)營養(yǎng)與功能食品研究室,吉林長春 130062)

糖蛋白是蛋白質(zhì)分子和糖鏈通過糖苷鍵相連的一類復(fù)合物[1],廣泛存在于動(dòng)物的體細(xì)胞和植物的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。糖蛋白因具有多糖和蛋白質(zhì)的部分性質(zhì),部分糖蛋白可以溶于水、酸、堿、鹽溶液和有機(jī)溶劑中。隨著對(duì)糖蛋白研究不斷深入,糖蛋白被定義為由比較短并且一般帶有分支的寡糖鏈和多肽在糖苷轉(zhuǎn)移酶的作用下,通過糖苷鍵共價(jià)連接所形成的結(jié)合蛋白[2]。

糖蛋白是生物體內(nèi)重要的生物大分子,可以參與細(xì)胞膜的形成,作為識(shí)別位點(diǎn)參與細(xì)胞間信息交流,同時(shí)還是抗體的重要組成成分[3]。糖蛋白對(duì)生長發(fā)育、細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞分化、信息傳遞和免疫調(diào)節(jié)均起著至關(guān)重要的作用[4]。隨著研究的不斷深入,糖蛋白的功能越來越多的被發(fā)現(xiàn),糖蛋白的價(jià)值也逐漸得到肯定。研究發(fā)現(xiàn)食源性糖蛋白具有抗氧化活性、免疫活性和抗腫瘤活性[4]。同時(shí),糖蛋白對(duì)人體具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和保健效果,其廣泛分布在中草藥[5-6]、菌體[7]、藻類[8]、禽畜類[9]以及大宗作物中[10]。

糖蛋白的組成結(jié)構(gòu)受糖鏈以及糖基化位點(diǎn)兩方面因素影響,糖鏈對(duì)蛋白質(zhì)的功能起到輔助和修飾作用,主要通過以下兩種方式:一種是影響分子內(nèi)的作用,如蛋白質(zhì)的折疊方式;另一種是影響分子間的作用,如細(xì)胞的粘附作用和抗原的結(jié)合。糖鏈結(jié)構(gòu)的微小差異可能導(dǎo)致糖蛋白的功能發(fā)生巨大變化。糖鏈結(jié)合到蛋白質(zhì)氨基酸殘基的過程,屬于非模版驅(qū)動(dòng),且糖鏈具有不均一性[11],同一糖鏈分子式中所表示的結(jié)構(gòu)較多,比如三個(gè)己糖組成的聚糖,其可能的序列會(huì)有26000多種[12]。糖鏈的單糖組成、數(shù)量關(guān)系、排列的方法和連接的位置都會(huì)造成糖鏈結(jié)構(gòu)的差異,進(jìn)而影響糖蛋白的功能。同時(shí),蛋白質(zhì)多肽鏈上發(fā)生糖基化的位點(diǎn)也會(huì)影響糖蛋白的性質(zhì)。研究表明雞蛋清中卵粘蛋白的高度糖基化是產(chǎn)生蛋白質(zhì)間粘度的主要原因,發(fā)生甘露糖基化的雞蛋清蛋白和卵白蛋白可以減輕人體對(duì)雞蛋的過敏反應(yīng)[13]。

本文對(duì)糖蛋白糖基化類型、糖基化解析方法以及生物質(zhì)譜在糖基化研究中的應(yīng)用進(jìn)行歸納和總結(jié),旨在為通過生物質(zhì)譜技術(shù)確定糖基化位點(diǎn)的策略提供參考,并為深入研究食源性糖蛋白的性質(zhì)和功能提供理論基礎(chǔ)。

1 糖蛋白的糖基化類型

糖蛋白的糖基化類型分為:N-糖基化、O-糖基化以及其他類型的糖基化。

目前,對(duì)于糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的研究主要集中在N-糖基化結(jié)構(gòu)中,由于共同的生物合成途徑,所有N-糖鏈都有一個(gè)結(jié)構(gòu)為Man3GlcNAc2的五糖核心,并可根據(jù)其附著的單糖如圖1所示[14]分為3類:寡糖甘露糖型糖鏈。其含有兩個(gè)N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和數(shù)量不確定的甘露糖(Man),有些還會(huì)存在部分葡萄糖基(Glc)的殘留;復(fù)合型糖鏈。其除了五糖核心外還有數(shù)量不定的GlcNAc、半乳糖(Gal)、巖藻糖(Fuc)和N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac),有時(shí)還會(huì)有N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)殘基;混合型糖鏈。其結(jié)合了寡聚半乳糖苷和復(fù)合型物種的特征。N-糖基化,起始于細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng),完成于高爾基體中,其中聚糖經(jīng)由GlcNAcβ-糖苷鍵連接到Asn-X-Ser/Thr(有時(shí)也是Cys)基序中的天冬酰胺(Asp)基團(tuán),其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸[15-16]。He等[17]證明了冬蟲夏草菌絲體中含有N-糖蛋白。

圖1 N-糖鏈結(jié)構(gòu)分類Fig.1 Classification of N-glycan structures

O-糖基化是在高爾基體中進(jìn)行,最普遍的形式是粘蛋白型O-糖基化,其糖鏈通過GalNAc與絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)殘基發(fā)生α-糖基化連接[18]。這些O-連接的糖鏈具有不同的核心結(jié)構(gòu),包含許多不同的核心區(qū)域,圖2為四種最常觀察到的類型[19]。粘蛋白型O-聚糖會(huì)在范圍內(nèi)發(fā)生變化,從單個(gè)殘基到延伸的寡糖鏈,類似于復(fù)合型N-聚糖,可以產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)變體[20]。與N-糖鏈的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較,O-糖鏈的單糖結(jié)構(gòu)相對(duì)比較簡單,但是結(jié)構(gòu)的類型和亞型更為復(fù)雜。詹玲等[21]通過β-消除反應(yīng)使糖蛋白中的糖鏈釋放,吸光度值在240 nm出有變化,鑒定出大豆中含有O-糖蛋白。

圖2 O-糖鏈主要核心結(jié)構(gòu)分類Fig.2 Classification of the main core of O-glycan structures

其它類型的糖基化在食源性糖蛋白中出現(xiàn)極少,主要分為C-糖鏈連接糖蛋白和糖基磷脂酰肌醇化糖蛋白兩種。C-糖鏈連接糖蛋白主要指的是糖鏈與蛋白殘基側(cè)鏈吲哚環(huán)上的碳原子通過碳碳鍵相連。此類糖基化很少見,僅在為數(shù)不多的天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)[22]。糖基磷脂酰肌醇化主要發(fā)生于錨定蛋白,這種糖基化主要影響細(xì)胞跨膜傳導(dǎo)[23]。錨定蛋白上的糖鏈通過C-末端與細(xì)胞膜上的糖基磷脂酰肌醇化的蛋白相連,將蛋白固定于細(xì)胞膜表面,而不跨越其磷脂雙分子層。

2 糖基化位點(diǎn)的解析技術(shù)

目前,糖基化位點(diǎn)解析的瓶頸在于:由于糖蛋白的微不均一性,一個(gè)糖基化位點(diǎn)上可能存在多個(gè)結(jié)構(gòu)不同的糖鏈結(jié)構(gòu),難以實(shí)現(xiàn)糖蛋白整體的結(jié)構(gòu)表征,只能分別從糖基化位點(diǎn)和糖鏈結(jié)構(gòu)兩個(gè)方面對(duì)糖蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。糖基化位點(diǎn)的解析技術(shù)主要分為核磁共振光譜技術(shù)(NMR)和生物質(zhì)譜技術(shù)。

2.1 核磁共振光譜技術(shù)

核磁共振光譜方法能夠?qū)μ擎湹乃薪Y(jié)構(gòu)特征進(jìn)行完整和明確的闡釋,包括單糖組分、端基構(gòu)型、單糖之間的連接類型以及它們的構(gòu)象,還有非糖取代基的位置[24-26]。但NMR仍有一些局限性:NMR靈敏度低,對(duì)樣品的純度要求高,需要大量純度較高的樣品量才可以獲得高分辨率光譜,在糖組學(xué)領(lǐng)域用到的樣品都是毫克級(jí),因此NMR技術(shù)在這一領(lǐng)域很少應(yīng)用;糖基化位點(diǎn)的確定只能通過得到的糖鏈結(jié)構(gòu)與已知糖蛋白進(jìn)行比對(duì),對(duì)于未知糖蛋白糖基化位點(diǎn)的解析會(huì)產(chǎn)生較大的誤差[27]。所以此方法更多的被應(yīng)用于糖鏈結(jié)構(gòu)的解析,而在N-糖基化位點(diǎn)檢測(cè)上則應(yīng)用較少。

2.2 生物質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜方法能夠高精度的檢測(cè)出微摩爾范圍內(nèi)的質(zhì)荷比,是糖組學(xué)中糖鏈分析和蛋白質(zhì)組學(xué)中糖基化位點(diǎn)鑒定的關(guān)鍵技術(shù)。質(zhì)譜儀的選擇和差異主要表現(xiàn)在離子源和質(zhì)量分析器。

常用離子源包括基質(zhì)輔助激光解析離子源(MALDI)和電噴霧離子源(ESI)。MALDI的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)生單電荷離子,儀器簡單,分析速度快并且對(duì)緩沖液、鹽和洗滌劑等低濃度污染物具有穩(wěn)定性[28-30],但是,這種類型的分析只能提供最可能存在的蛋白結(jié)構(gòu),不能完整的定義碳水化合物結(jié)構(gòu)。ESI的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)生多電荷離子,降低了被測(cè)物的質(zhì)荷比,拓寬了分子量分析的范圍,靈敏度高于MALDI,缺點(diǎn)是檢測(cè)中所使用的緩沖劑必須與電離條件相容,因?yàn)镋SI對(duì)污染物的存在十分敏感[31-32]。常用的質(zhì)量分析器有飛行時(shí)間(TOF)、四級(jí)桿(Q)、離子阱(IT)、傅里葉變換離子回旋共振(FTICR)和電場(chǎng)軌道阱回旋共振(Obritrap)等[33]。質(zhì)量分析器的結(jié)構(gòu)和性能不同,而每個(gè)方法都有各自的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì),IT可以進(jìn)行10級(jí)分析(MSn),但靈敏度較低且存在低質(zhì)量端缺失效應(yīng);FTICR和Obritrap的分辨率高,可達(dá)十萬以上,但掃描時(shí)間較長;TOF和Q的分析靈敏度較高,時(shí)間短,但只能進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。

在糖肽整體的檢測(cè)中,為實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)更全面的獲得糖肽的離子譜圖,通常將多個(gè)質(zhì)量分析器串聯(lián),如MALDI-QIT-TOF和MALDI-TOF-TOF,以及將質(zhì)譜分析器與碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)、高能碰撞裂解(HCD)、電子捕獲裂解(ECD)和電子轉(zhuǎn)移裂解(ETD)等多種質(zhì)譜碎裂方式配合使用[34-38],可以為數(shù)據(jù)的分析提供更全面的信息。

核磁共振光譜法雖然可以準(zhǔn)確檢測(cè)糖鏈的結(jié)構(gòu),但由于糖鏈部分可能存在多種異構(gòu)體,對(duì)于糖基化位點(diǎn)的分析不準(zhǔn)確。相比之下,生物質(zhì)譜技術(shù)的譜圖解析過程繁瑣,與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)的工作量較大,但可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于糖基化位點(diǎn)和糖鏈結(jié)構(gòu)的快速檢測(cè),結(jié)果準(zhǔn)確。同時(shí)生物質(zhì)譜技術(shù)可以從糖肽整體角度對(duì)糖蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,可以在保證檢測(cè)準(zhǔn)確性的同時(shí),簡化實(shí)驗(yàn)的流程。因此,生物質(zhì)譜技術(shù)更廣泛的被應(yīng)用在糖基化位點(diǎn)和肽段序列的檢測(cè)中。

3 生物質(zhì)譜技術(shù)解析糖蛋白糖基化位點(diǎn)的應(yīng)用

應(yīng)用生物質(zhì)譜技術(shù)對(duì)于糖蛋白整體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,主要的研究內(nèi)容是N-糖基化位點(diǎn)以及發(fā)生糖基化的肽段序列兩個(gè)方面,研究方法主要有以下兩種。

3.1 基于去糖基化肽段的糖基化位點(diǎn)分析

目前,對(duì)于去糖基化后進(jìn)行糖基化位點(diǎn)確定的方法有兩種,二者在去糖基化的處理方法上基本一致,只是在質(zhì)譜圖的分析上存在差異。

3.2 基于糖肽的糖基化位點(diǎn)分析

基于糖肽的糖基化位點(diǎn)分析相比于去糖基化的方法,可以在不丟失特異性糖基化信息的前提下,更直接地獲得蛋白質(zhì)和糖鏈之間的連接信息,并更接近于待測(cè)糖蛋白樣品的真實(shí)狀態(tài)[44]。此方法主要分為兩種。一種為依靠已知譜庫數(shù)據(jù)進(jìn)行的數(shù)據(jù)掃描方式。糖蛋白在被多種蛋白酶聯(lián)合切割后,用凝集素對(duì)獲得的糖肽進(jìn)行富集,在液相色譜中進(jìn)行純化并對(duì)所得到的各個(gè)單一組分進(jìn)行質(zhì)譜解析,即對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)到的信號(hào)最強(qiáng)的母離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析,得到子離子峰,并對(duì)子離子峰進(jìn)行三級(jí)質(zhì)譜分析,以此類推,再將每級(jí)質(zhì)譜圖中的峰所在質(zhì)荷比與譜庫進(jìn)行比較,從而獲得肽段的序列以及糖基化位點(diǎn)。Franc等[45]用伴刀豆球蛋白凝集素(Con A)富集糖肽的策略,分析了豌豆幼苗銅銨氧化酶(PSAO)和小扁豆銅銨氧化酶(LSAO)的糖基化位點(diǎn),得出了PSAO上有Asn334和Asn558兩個(gè)糖基化位點(diǎn),其中Asn558上有4條糖鏈;LSAO上有一個(gè)糖基化位點(diǎn),上面結(jié)合了7條糖鏈。由于糖肽的特殊結(jié)構(gòu),在質(zhì)譜檢測(cè)中對(duì)所使用的串聯(lián)質(zhì)譜儀質(zhì)量分析器有較高要求,首先,因?yàn)樘请牡姆肿淤|(zhì)量比肽段的分子質(zhì)量大,所以一級(jí)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器要有足夠?qū)挼馁|(zhì)量檢測(cè)范圍;其次,因?yàn)樘擒真I和氫鍵會(huì)在二級(jí)質(zhì)譜中碰撞破裂,所以二級(jí)質(zhì)譜中,糖肽的碎片離子集中在低質(zhì)量區(qū),這就要求二級(jí)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器要對(duì)低質(zhì)量區(qū)全面的覆蓋[46],因此,TOF和FTICR在糖肽的二級(jí)質(zhì)譜分析中較為常用。傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(FTICR-MS)中的CID破碎方式和ETD破碎方式相結(jié)合,就可以在不使用PNGase F酶切除糖鏈的情況下,對(duì)發(fā)生糖基化的肽段序列、糖基化位點(diǎn)和糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,二者破碎方式如圖3[48]。利用離子阱質(zhì)量分析器進(jìn)行的質(zhì)譜檢測(cè),雖然由于糖蛋白的微不均一性,一個(gè)肽段所連接的糖鏈可能會(huì)存在異構(gòu)體,導(dǎo)致計(jì)量水平低于非糖基化的肽段而不能得到低質(zhì)量端的碎片信息,卻可以實(shí)現(xiàn)多級(jí)質(zhì)譜的分析,如Zhang等[47]利用五級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)一種標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白進(jìn)行檢測(cè),在四級(jí)譜圖中得到了糖蛋白的肽段序列和糖基化位點(diǎn),所以此方法可以進(jìn)行已知糖蛋白高質(zhì)量端的糖基化位點(diǎn)驗(yàn)證。

圖3 CID和ETD碎裂規(guī)則對(duì)比Fig.3 Comparison of CID and ETD fragmentation rules

另一種方法為靶向性掃描,相比于依靠數(shù)據(jù)的掃描方式,靶向性掃描能獲得更完整的糖肽序列。靶向性掃描的原理是設(shè)置前體離子掃描的質(zhì)譜,根據(jù)設(shè)定的破碎后的子離子掃描母離子,從而獲得糖肽的結(jié)構(gòu)。Ritchie等[49]設(shè)定靶向質(zhì)荷比204離子和Y1離子的前體離子掃描方式,提高了質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度,同時(shí)能鑒定出更多的糖肽異構(gòu)體。目前,這種方法在食源性糖蛋白的鑒定中尚未有應(yīng)用記錄,未來可應(yīng)用在糖蛋白低質(zhì)量端的糖基化位點(diǎn)驗(yàn)證。

4 展望

近年來,隨著質(zhì)譜技術(shù)等方法的不斷發(fā)展,N-糖基化位點(diǎn)及肽段序列已經(jīng)可以被準(zhǔn)確的檢測(cè)出來,但是由于糖鏈的微不均一性,糖基化位點(diǎn)上所連接的糖鏈個(gè)數(shù)及糖鏈結(jié)構(gòu)尚不明確。目前,對(duì)于發(fā)生N-糖基化的糖蛋白研究很多,但是由于O-糖基化的結(jié)構(gòu)多變性,導(dǎo)致對(duì)O-糖基化糖蛋白的結(jié)構(gòu)研究較少。同時(shí),對(duì)于食源性糖蛋白結(jié)構(gòu)影響功能的作用機(jī)理尚不清楚。因此,在未來研究中,研究的重點(diǎn)應(yīng)該側(cè)重于對(duì)O-糖基化位點(diǎn)與糖鏈結(jié)構(gòu)的研究,闡述和證明食源性糖蛋白能發(fā)揮作用的機(jī)理及其構(gòu)效關(guān)系等方面為食源性糖蛋白的綜合利用以及新型藥物和保健食品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。