基于電子鼻和HSSPMEGCMS技術(shù)解析烏牛早茶的揮發(fā)性風味物質(zhì)

湯莎莎,蘆晨陽,周 君,韓姣姣,張紅燕,崔晨茜,蘇秀榕

(寧波大學海洋學院,浙江寧波 315211)

烏牛早是我國古代名茶,有研究發(fā)現(xiàn)烏牛早含有17.6%的茶多酚,4.2%的氨基酸和3.4%的咖啡堿,具有抗衰老、抗菌、抗癌等多種作用[3],有較高的經(jīng)濟效益。目前,對烏牛早的研究主要集中于其加工工藝,而對烏牛早在加工過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)差異性的研究較少。

香氣是茶葉品質(zhì)的重要體現(xiàn),也是捕獲和培養(yǎng)消費者忠誠度的重要因素,它對茶葉品質(zhì)的貢獻率達25%～40%[4-5]。目前國內(nèi)外已有大量關(guān)于綠茶茶葉的香氣成分研究報道。Pongsuwan等[6]利用熱解儀偶聯(lián)GC/MS為基礎(chǔ)的代謝指紋圖譜預測日本綠茶的質(zhì)量。郭建華等[7]采用頂空固相微萃取—氣質(zhì)聯(lián)用法分析了由烏牛早、鳩坑、福云6號3個早春綠茶的香氣成分,發(fā)現(xiàn)烏牛早揮發(fā)性成分中的醇類化合物為57.6%,顯著高于鳩坑和福云6號。龍立梅等[8]也采用相同的技術(shù),對西湖龍井、黃山毛峰和信陽毛尖3種名優(yōu)綠茶特征香氣成分進行分析,發(fā)現(xiàn)這3種綠茶的香氣成分主要為醇類、酯類、醛類和酮類,其香氣成分沒有較大差異,香氣成分的相對含量具有一定差異性。因此利用香氣和揮發(fā)性成分的測定可以直觀、快速地來判斷烏牛早嫩葉和老葉揮發(fā)性物質(zhì)成分的差異性與品質(zhì)好壞。

電子鼻是一種與生物嗅覺原理相似的儀器,氣味分子被傳感器吸附,產(chǎn)生的信號經(jīng)處理加工與傳輸,再經(jīng)模式識別做出判斷。因此已經(jīng)有研究通過電子鼻數(shù)據(jù)的預處理及模式識別對茶葉香氣進行識別與分類、建立茶葉等級模型、區(qū)分不同制作工藝的茶葉等作用[9]。陳哲等[10]采用電子鼻傳感器陣列區(qū)分不同等級碧螺春,研究表明,氣體傳感器陣列平臺可用于茶葉香氣的采集和分析,可以有效地對茶葉香氣差異性做出準確判斷。因此本文利用電子鼻技術(shù)來實現(xiàn)高效快速地檢測烏牛早嫩葉和老葉揮發(fā)性物質(zhì)差異。

生產(chǎn)上主要是利用烏牛早嫩葉來制成茶葉,而忽略了烏牛早老葉的利用,有效地利用老葉能大大提高烏牛早的附加值。因此,本文利用電子鼻檢測不同溫度下的烏牛早茶葉揮發(fā)性物質(zhì)的變化趨勢,并結(jié)合HS-SPME-GC-MS分析嫩葉與老葉的揮發(fā)性成分,以期探明烏牛早嫩葉和老葉在香味上的差異、加熱溫度與香氣的關(guān)系,為烏牛早茶葉相關(guān)產(chǎn)品的進一步開發(fā)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烏牛早葉 樣品分為嫩葉(一芽兩葉)和老葉(未脫落的老茶葉),浙江省新昌縣茶場。

PEN3型電子鼻 德國Airsense公司;7890GC型氣相色譜儀美國Agilent公司;M7-80Ei型質(zhì)譜儀北京普析通用儀器有限責任公司;65 μm聚二甲基硅氧烷萃取頭美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 稱取0.1 g烏牛早茶葉于樣品瓶中,壓蓋密封,分為5組,分別為在常溫(22±4) ℃下的樣品和經(jīng)過40、60、80、100 ℃恒溫加熱處理30 min的樣品。用于電子鼻和GC-MS分析。

1.2.2 電子鼻檢測 樣品加熱處理后冷卻30 min,待其達到頂空平衡后進行電子鼻氣味分析,每組5個平行。數(shù)據(jù)采集時間300 s,傳感器清洗時間400 s,進樣流量300 mL/min。

1.2.3 HS-SPME-GC-MS分析 將65 μm聚二甲基硅氧烷萃取頭放入氣相色譜的進樣口,溫度250 ℃,老化時間45 min。將老化后的萃取頭插入樣品瓶中,在60 ℃水浴中吸附30 min后取下,插入氣相色譜的進樣口,于250 ℃下解吸附3 min,進行GC-MS分析。

色譜條件:VOCOL毛細管色譜柱(60 m×0.32 mm×1.8 μm);載氣He,流速0.3 mL/min;不分流模式進樣,恒壓35 kPa;進樣口溫度與接口溫度均為210 ℃,檢測溫度210 ℃;程序升溫:起始柱溫35 ℃保持2 min,以3 ℃/min升至40 ℃,保留1 min,再以5 ℃/min升至210 ℃,保持25 min。

質(zhì)譜條件:電子轟擊源(EI);電子能量:70 eV;離子源溫度:200 ℃;掃描質(zhì)量范圍:45～1000 u。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用WinMuster軟件對電子鼻測得數(shù)據(jù)進行線性判別分析(LDA)和判別函數(shù)分析(DFA)。通過NIST和WILEY譜庫對測得的揮發(fā)性成分進行檢索分析,采用歸一化法來確定各組分的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻檢測結(jié)果

圖1所示,圖中每個橢圓分別代表各個溫度下嫩葉和老葉的數(shù)據(jù)采集點,不同烏牛早茶葉在不同溫度處理條件下的主成分分析(PCA)總貢獻率為95.278%,說明PCA分析可有效區(qū)分不同溫度處理條件下烏牛早嫩葉與老葉的氣味。烏牛早嫩葉在不同溫度加熱下氣味發(fā)生了變化,并呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律,氣味特征越相似,數(shù)據(jù)分布越緊密[11]。烏牛早的老葉與嫩葉在常溫狀態(tài)下、40、60、80和100 ℃加熱下數(shù)據(jù)分布在不同位置,隨著溫度的升高,氣味不斷發(fā)生著變化。

圖1 不同烏牛早茶葉在不同溫度下的主成分分析(PCA)Fig.1 PCA analysis of different varieties ofdifferent Wu Niuzao leaves at different temperature

取相同溫度下的不同烏牛早茶葉樣品,用判別函數(shù)(DFA)法來進行驗證分析。從圖2～圖6的左圖可以看出,在常溫和經(jīng)過40、60、80、100 ℃加熱處理的樣品,它們的LDA總貢獻率都大于85%,且同一溫度下的老葉和嫩葉的揮發(fā)性氣味沒有重疊,說明電子鼻可以區(qū)分相同溫度下嫩葉和老葉的氣味;在不同溫度加熱處理的嫩葉氣味曲線均可穿過模板中對應(yīng)樣品的氣味數(shù)據(jù)點并重合;圖2～圖6的右圖是對左圖氣味曲線最終走向是嫩葉的驗證。經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn),不同溫度下的嫩葉樣品的氣味曲線穿過模型,再經(jīng)過分析,將待測樣品進行歸類、判定,都能找到與其相對應(yīng)的嫩葉所在的氣味區(qū)域并與其重合,這說明老葉和嫩葉在不同溫度下都能被電子鼻能很好地區(qū)分開[12]。

圖2 常溫下不同烏牛早茶葉的判別函數(shù)(DFA)驗證結(jié)果Fig.2 Validation results from DFA ofdifferent Wu Niuzao leaves at room temperature

圖3 40 ℃下不同烏牛早茶葉的判別函數(shù)(DFA)驗證結(jié)果Fig.3 Validation results from DFA ofdifferent Wu Niuzao leaves at 40 ℃

圖4 60 ℃下不同烏牛早茶葉的判別函數(shù)(DFA)驗證結(jié)果Fig.4 Validation results from DFA ofdifferent Wu Niuzao leaves at 60 ℃

圖5 80 ℃下不同烏牛早茶葉的判別函數(shù)(DFA)驗證結(jié)果Fig.5 Validation results from DFA ofdifferent Wu Niuzao leaves at 80 ℃

圖6 100 ℃下不同烏牛早茶葉的判別函數(shù)(DFA)驗證結(jié)果Fig.6 Validation results from DFA ofdifferent Wu Niuzao leaves at 100 ℃

2.2 HS-SPME-GC-MS分析

2.2.1 嫩葉的揮發(fā)性成分 采用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析嫩葉常溫和經(jīng)過40、60、80、100 ℃恒溫加熱處理下的氣味成分,共鑒定出15、20、14、17和17種揮發(fā)性成分。嫩葉的揮發(fā)性成分總共有32種化合物,其中烴類9種、醛類8種、醇類10種、酮類1種、雜環(huán)類1種、酯類2種、其他1種。各組分的結(jié)果如表1所示。

表1 不同溫度處理嫩葉樣品的GC-MS分析結(jié)果Table 1 GC-MS analysis results for treated shoots at different temperatures

嫩葉在常溫下最主要的揮發(fā)性物質(zhì)是醇類,總含量為78%。其中醇類物質(zhì)中含量較高的為芳樟醇(39.46%)、芐醇(9.89%)、橙花醇(16.75%)和苯乙醇(6.89%)。酯類中的水楊酸甲酯(13.62%)相對含量也較高。經(jīng)過40、60、80和100 ℃的加熱后,醇類物質(zhì)還是嫩葉的最主要揮發(fā)性成分,醛類物質(zhì)所占含量略有上升。其中醇類物質(zhì)中含量較高的芳樟醇,其相對含量隨處理溫度的升高呈波動上升趨勢,在80 ℃時顯示的相對含量最高。

芳樟醇為高沸點化合物,因此隨著溫度的上升,揮發(fā)性物質(zhì)中芳樟醇相對含量增大。有研究發(fā)現(xiàn)芳樟醇、香葉醇、橙花醇和香草醇,互為異構(gòu)體,在酶或熱的作用下,會發(fā)生互變[13]。

橙花醇在經(jīng)過恒溫加熱處理后,其相對含量與芳樟醇呈一定的負相關(guān),與相關(guān)研究結(jié)論相符。由此推測可能是加熱導致烏牛早嫩葉揮發(fā)性物質(zhì)中的芳樟醇與橙花醇發(fā)生了一定程度的互變,或是產(chǎn)生橙花醇和芳樟醇相關(guān)兩種水解酶的活性隨著溫度改變而發(fā)生變化,從而使得它們相對含量出現(xiàn)變化。烯烴中的甲苯,隨溫度的升高呈波動上升趨勢,在嫩葉加熱的過程中甲苯經(jīng)過一系列氧化反應(yīng)生成苯甲醇和苯甲醛等衍生物,60 ℃為甲苯最適反應(yīng)溫度,從而在60 ℃未被檢出[14]。苯甲醇的相對含量隨溫度的升高整體呈下降趨勢。苯乙醇以糖苷的形式存在于茶鮮葉中,隨著溫度的上升,糖苷水解酶活性增強,香氣前體物質(zhì)水解,釋放出香氣物質(zhì),在60 ℃時苯乙醇含量上升到10.83%,而后隨著溫度的上升由于超過了相關(guān)水解酶的最適溫度所以苯乙醇相對含量下降[15]。酯類中的主要揮發(fā)性物質(zhì)水楊酸甲酯也以糖苷的形式存在于茶鮮葉,它的含量也是呈波動上升狀態(tài),與不同溫度下糖苷水解酶活性強弱有關(guān)[13]。嫩葉在不同條件下少量被檢出有香甜氣味的β-月桂烯、有花香氣味的α-法尼烯、松木香的β-蒎烯、具薔薇花溫暖性花香的苯基乙醇、花甜香的正癸醛、風信子香的苯乙醛、茉莉花香的茉莉酮、花果香的辛醛和壬醛,曾在不同類型的茶葉中被檢出,是常規(guī)的香氣成分[16]。而在嫩葉揮發(fā)性成分中被檢出少量含量的四十四烷、順馬鞭草烯醇、反式-2-癸烯醇等,在各類茶葉中還未有相關(guān)文獻報導,推測可能是由于前處理不當產(chǎn)生。

2.2.2 老葉的揮發(fā)性成分分析 采用HS-SPME-GC-MS從常溫和經(jīng)過40、60、80、100 ℃恒溫處理的老葉中共檢測出21、21、19、18和27種揮發(fā)性成分。其中烴類8種、醛類7種、醇類13種、酯類17種、其他4種,共計49種化合物。各組分結(jié)果如表2所示。

表2 不同溫度處理老葉樣品的GC-MS分析結(jié)果Table 2 GC-MS analysis results for old leaf samples treated at different temperatures

續(xù)表

烏牛早老葉在常溫情況下的最主要揮發(fā)性成分是酯類物質(zhì),其總含量為61.34%。其中相對含量較高為水楊酸甲酯(34.19%)、4-己烯-1-醇乙酸酯(12.09%)和2-氨基苯甲酸-3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇酯(5.77%)。此外,醇類中的順-3-己烯-1-醇(10.76%)和烴類里面的甲苯(7.8%)也為老葉的主要揮發(fā)性物質(zhì)。

經(jīng)過40、60、80、100 ℃的加熱處理后后,酯類依然是老葉的主要揮發(fā)性物質(zhì),醇類物質(zhì)所占含量略有上升。酯類中相對含量最高的是水楊酸甲酯,高溫作用會加強茶葉體內(nèi)酯類反應(yīng),促進酯類物質(zhì)的生成,因此隨著溫度的升高水楊酸甲酯的相對含量呈波動上升狀態(tài)[17]。醇類也是老葉的主要揮發(fā)性物質(zhì)之一,總含量先上升,到60 ℃時達到最大值45.29%,80 ℃降至24.18%,100 ℃后又上升。醇類中的主要揮發(fā)性物質(zhì)為順-3-己烯-1-醇,又名青葉醇,是由亞麻酸在酶的作用下氧化裂解,再經(jīng)醇脫氫酶作用產(chǎn)生[18]。在60 ℃時青葉醇含量達最大值16.5%,后隨溫度的升高,相關(guān)酶的活性降低從而使它的含量隨溫度的上升逐漸下降。烴類總含量整體趨勢較平穩(wěn)在9%左右,和嫩葉相比老葉中的甲苯含量略高。

在老葉被檢測出揮發(fā)性物質(zhì)中,具有薔薇花香的苯基乙醇、清香的辛醇、青草氣的戊醇和庚醇、甜花香的正癸醛、茶青氣得己醛、青草氣的戊醛和有研究發(fā)現(xiàn)在信陽毛尖中含量較高,呈強烈彌散性水果香味的順-己酸-3-己烯酯[17,19],在各類茶葉曾被檢測出來,是常規(guī)的香氣物質(zhì)。而其他少量被檢出的8-十七烷烯、1-十六碳烯等揮發(fā)性物質(zhì),未有研究報導解釋,推測可能是操作不當導致。

3 討論

茶葉中不同濃度和比例的芳香物質(zhì)對嗅覺神經(jīng)產(chǎn)生作用,使人覺察到的茶葉特有的氣味,即為茶葉香氣。目前在茶葉中檢測到的揮發(fā)性成分多達100多種,主要包括碳氧化合物、醇類、酮類、醛類、酷類、甲氧基苯類、酸類、內(nèi)酯類、含氮和雜氧化合物等[20]。這些香氣化合物以不同比例的混合,構(gòu)成了不同茶香和類型的茶葉。在本次實驗中測得嫩葉的香氣成分主要是芳樟醇、橙花醇、苯甲醇、苯基乙醇和水楊酸甲酯等,以具有花果香的萜烯醇類化合物為主要揮發(fā)性物質(zhì)。而老葉的香氣成分主要是水楊酸甲酯、4-己烯-1-醇乙酸酯和2-氨基苯甲酸-3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇酯,3-己烯-1-醇和甲苯等,以具有青草味的化合物為主要揮發(fā)性物質(zhì)。

在常溫情況下,嫩葉的香氣成分種類較少,以帶有特殊的花香和果香[21]的醇類化合物為主。在綠茶[22]、烏龍茶[23]及紅茶[24]檢測出的揮發(fā)性成分中,芳樟醇等萜烯醇類物質(zhì)含量較高,有研究認為芳樟醇是評價茶葉香氣品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標,它有柑橘、萜香、花香、甜的清香及木香,香氣柔和、持久,是形成清爽花香的主要香氣成分[25];橙花醇有甜香的玫瑰氣味,還微帶檸檬的清香[26]。苯甲醇特有的令人愉快的水果香氣和強烈的熏烤味,它由甲苯進行氧化反應(yīng)生成。苯乙醇有香甜玫瑰花的氣味,還略帶面包香[27]。這些醇類物質(zhì)可能對烏牛早嫩葉的香型有一個較好的協(xié)調(diào)作用,能使烏牛早的味道更加清新、醇和。隨著溫度的增加,嫩葉中的醇類物質(zhì)相對含量不斷上升,在80 ℃時含量最高,在100 ℃時醇類物質(zhì)的揮發(fā)性成分又略有下降,這與酶促作用和熱化學作用有關(guān),其促使糖甙水解,在溫度超過酶的最適溫度鈍化了酶的活性,從而使具有花果香的醇類物質(zhì)含量下降[28]。

烏牛早老葉的醇類物質(zhì)種類比嫩葉多,但在總揮發(fā)性成分中所占含量相對較少。在烏牛早嫩葉中檢出含量較高,對香氣組成有重要作用的芳樟醇,具有鈴蘭香、玉蘭花香、玫瑰花香[29]等香味,但在烏牛早老葉中各個溫度下都未被檢出。另一方面在烏牛早嫩葉中檢出帶有花果香的橙花醇,在老葉中只有常溫和經(jīng)過40、60 ℃加熱處理的情況下才被少量檢出。有研究表明以單萜烯醇、芳香族醇和脂肪族醇為配基的β-櫻草糖苷和β-葡萄糖苷,這些糖苷物質(zhì)釋放出揮發(fā)性配基是花果香的基礎(chǔ)[30]。由此推測可能是老葉中缺乏此類糖苷物質(zhì),從而在老葉的揮發(fā)性成分中無法檢測出具有花果香的萜烯醇。順-3-己烯-1-醇又稱葉醇沸點較低,高濃度的葉醇具有較強烈的青草氣,經(jīng)過高溫殺青會使葉醇揮發(fā)殆盡,稀釋后的葉醇具有清香[31]。它在老葉的香氣成分中含量較高,是老葉重要的特征性香氣,在60 ℃時相對含量達到最大值,在烏牛早嫩葉中只在常溫下被檢出。以此推測可能是葉醇的前提物質(zhì)亞麻酸在嫩葉的含量較少所致。苯甲醇在老葉的香氣成分中含量比嫩葉略小,其含量在不同溫度下老葉的香氣成分中都占4%左右,對老葉香氣貢獻較小。

醛類物質(zhì)在烏牛早的嫩葉和老葉中被檢出的含量很低,種類也較少,老葉的醛類含量總體比嫩葉要高。嫩葉和老葉的醛類物質(zhì)中主要揮發(fā)性成分都有苯甲醛和正癸醛,而嫩葉的醛類物質(zhì)中主要香氣物質(zhì)還多了檸檬醛,檸檬醛的化學性質(zhì)較活潑,容易發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成香葉酸或香葉醇/橙花醇,檸檬醛有強烈的檸檬樣香氣,特有的苦甜味道[32]。苯甲醛具有特殊的苦杏仁氣味。正癸醛有顯著的脂肪氣息,甜香及柑橘香韻,稀釋時有特殊的花香,這種醛主要提供花香和脂肪氣息[33]。嫩葉在溫度80 ℃下被檢測出辛醛,在其他處理情況下未被檢出,它有醛香、蠟香、青果皮香及明顯的脂肪和水果氣味[34],還未證實其對烏牛早香味的形成是否具有顯著性貢獻。醛類化合物在烏牛早的揮發(fā)性成分中,整體上的相對含量較低,種類較少,推測其對嫩葉與老葉的香氣貢獻不大。

嫩葉的揮發(fā)性成分中被檢出的酯類物質(zhì)與其他茶葉相差較大,如廣泛存在于烏龍茶中具有典型花香味的茉莉酮酸甲酯、己酸己酯等[35]在烏牛早中均未被檢出。具有冬青油草藥香味的水楊酸甲酯在不同烏牛早茶葉中含量較高,尤其是在80 ℃在老葉的揮發(fā)性成分中含量最高。4-己烯-1-醇乙酸酯在老葉未處理下的香氣成分中,含量相對較高,但由于沒有對4-己烯-1-醇乙酸酯味道的相關(guān)研究,因此不能判斷它是否對老葉香氣成分有貢獻。順-己酸-3-己烯酯具有強烈彌散性梨香[23],由于在老葉的香氣成分檢出量少,推測對其香氣成分貢獻不大。有研究表明,酯類化合物是形成茶葉特色的香氣[36]。

烴類化合物在烏牛早的揮發(fā)性成分中被檢出,不飽和烴對茶香的組成起著重要作用,飽和烴對茶葉的特征性香氣成分無顯著性貢獻。嫩葉的揮發(fā)性成分中檢測出的順-β-金合歡烯有青香、花香并伴有香脂香氣,且是香料良好的溶劑[37]。甲苯在老葉的香氣成分中含量較高,在嫩葉中含量較低,具有類似于苯的強烈的芳香氣味,對老葉的特征性香氣成分有貢獻作用。烴類化合物整體上在嫩葉的香氣成分中含量低,種類少,推測對嫩葉的香氣貢獻不大。而在老葉中烴類化合物的含量相對于嫩葉要高很多,尤其是甲苯對老葉的香氣有較大的貢獻。

酮類物質(zhì)只在烏牛早嫩葉中被檢出,含量不高。在綠茶[38]及烏龍茶[39]中的茉莉酮在烏牛早嫩葉中也被發(fā)現(xiàn),呈優(yōu)雅茉莉花香和芹菜籽香氣,但含量較低,對烏牛早茶葉的香氣組成無貢獻較小。

4 結(jié)論

采用HS-SPME-GC-MS的方法檢測烏牛早茶葉的香氣成分,發(fā)現(xiàn)嫩葉的主要特征香氣成分清香的芳樟醇、微帶檸檬和玫瑰氣味的橙花醇、冬青油草藥香味的水楊酸甲酯、花香和脂肪氣息的正癸醛、花果香的順-β-金合歡烯。在80 ℃時,嫩葉的揮發(fā)性物質(zhì)中萜烯醇類物質(zhì)相對含量最高,此時嫩葉呈花果香味最濃郁。因此在烏牛早嫩葉相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中,為提高產(chǎn)品香氣品質(zhì),在80 ℃左右的加熱處理能使烏牛早最大化地揮發(fā)舒適的花果香。

老葉的主要特征香氣為草藥香味的水楊酸甲酯和清涼葉草香氣的葉醇,而缺少花果香的呈味物質(zhì)[40]。在老葉的揮發(fā)性成分中80 ℃下的水楊酸甲酯相對含量最高,高達43.07%。現(xiàn)如今在生產(chǎn)實踐中已經(jīng)把水楊酸甲酯用于香料、口腔藥劑及溶劑類賦香劑[41],被廣泛地用于防腐劑、固定液及食品等香料中,水楊酸甲酯也可生產(chǎn)止痛藥、殺蟲劑、油墨以及纖維助染劑等輕化工領(lǐng)域。由此研究發(fā)現(xiàn)老葉中含有大量的水楊酸甲酯,可以用作提取水楊酸甲酯的原料,從而提高烏牛早茶樹的利用率和附加值。