融合疏水蛋白在銀耳中的異源表達(dá)

陳少敏,朱涵予,劉冬梅,許丹云,馬愛民

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430070)

疏水蛋白(Hydrophobins)是目前已知的一類表面活性極強(qiáng)的小分子量兩性蛋白,約含有100個(gè)氨基酸,分子量約為10 kDa,廣泛存在于各種絲狀真菌中。根據(jù)氨基酸排列方式和性質(zhì)的不同,疏水蛋白分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種[1]。I型疏水蛋白自我裝配形成的蛋白膜具有高度的不溶解性,即使在100 ℃水浴時(shí)也難溶解于2% SDS,只有在強(qiáng)酸如甲酸和三氟乙酸中才可以被解離[2-3]。疏水蛋白一個(gè)非常重要的特性就是當(dāng)它們遇到親水―疏水界面時(shí)就會(huì)發(fā)生自組裝,形成一層兩親性的薄膜,厚度約為10 nm,性質(zhì)十分穩(wěn)定,且能改變界面的親水性和疏水性[4-5]。因此,疏水蛋白在食品、醫(yī)學(xué)、工業(yè)等領(lǐng)域具有強(qiáng)大的應(yīng)用前景,如疏水蛋白的乳化性可以作為許多食品的穩(wěn)定劑、疏水性可用于食品的保鮮[6-7]以及用作生物材料[8-9]、疏水蛋白SC3在小鼠模型也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤作用[10]。

銀耳(Tremellafuciformis),又稱白木耳、雪耳等,在分類學(xué)上隸屬于真菌門,擔(dān)子菌綱,異隔擔(dān)子菌亞綱,銀耳目,銀耳科,銀耳屬[11]。銀耳被譽(yù)為“菌中之冠”,是一種珍貴的食用藥用兩用菌。銀耳能產(chǎn)生酵母狀的單核體芽孢,是一種良好的生物反應(yīng)器[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)室前期從平菇菌絲中克隆到Ⅰ型疏水蛋白基因Po.hyd[14],并在銀耳芽孢中成功實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)[15]。為進(jìn)一步改善疏水蛋白的性質(zhì),充分利用疏水蛋白的潛在應(yīng)用和銀耳的可食性優(yōu)勢,本實(shí)驗(yàn)試圖用分子生物學(xué)的方法對(duì)疏水蛋白進(jìn)行改造,將平菇疏水蛋白基因hyd與去除終止密碼子的hyd拼接,形成融合疏水蛋白H-H,并導(dǎo)入到銀耳芽孢中表達(dá),希望改善疏水蛋白的性質(zhì),同時(shí)也為其他蛋白質(zhì)的改性研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀耳芽孢32Y、平菇菌絲P739、根癌農(nóng)桿菌EHA105 本實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒pEGH 由本實(shí)驗(yàn)室朱涵予改造pCAMBIA1302質(zhì)粒并保存[16];大腸桿菌DH5α、pMD18-T克隆載體、限制性內(nèi)切酶SacⅠ、MluⅠ、BamHⅠ、AsuⅡ、XhoⅠ 大連TaKaRa;T4 DNA Ligase 美國Promega;凝膠純化試劑盒、回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒 美國Axygen;Southern雜交試劑盒 美國GE;PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基;YEB培基、IM培養(yǎng)基、Co-CM培養(yǎng)基、三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA) Sigma公司;低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn) TaKaRa公司;其他試劑 均為分析純。

PCR儀 美國Bio-Rad公司;冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 PDA培養(yǎng)基:稱取46 g PDA粉末,用蒸餾水定容至1 L,添加1.5% 瓊脂粉,121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

YEB培養(yǎng)基:蛋白胨5 g/L,酵母提取物1 g/L,營養(yǎng)肉湯5 g/L,蔗糖5 g/L,七水硫酸鎂0.5 g/L,NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2,用蒸餾水定容至1 L,添加1.5%瓊脂粉,121 ℃,30 min高溫高壓滅菌。

MM培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,硫酸銨1.32 g(含N 20 mmoL/L),MgSO4·7H2O 0.25 g,kH2PO4·3H2O 0.5 g,VB1 0.2 mg,ZnSO4·7H2O 2 mg,CaCl2·2H2O 0.5 g,鉬酸銨 0.02 mg,補(bǔ)足ddH2O定容至1 L,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

IM培養(yǎng)基:20×磷酸緩沖溶液5 mL,20×鹽溶液5 mL,50% 甘油1 mL,1 mol/L葡萄糖溶液1 mL,1 mol/L MES溶液4 mL,200 mmol/L AS溶液0.1 mL,補(bǔ)足ddH2O定容至100 mL。

Co-CM培養(yǎng)基:20×磷酸緩沖溶液5 mL,20×鹽溶液5 mL,50%甘油1 mL,1 mol/L葡萄糖溶液0.5 mL,1 mol/L MES溶液4 mL,200 mmol/L AS溶液0.1 mL,補(bǔ)足ddH2O定容至100 mL。

1.2.2 基因的克隆及載體的構(gòu)建 根據(jù)NCBI上發(fā)表的Po.hyd(GenBank登錄號(hào)為No.AF331452.1),利用軟件Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì),如表1所示。

表1 所用引物序列Table 1 Primers used in this study

收集PDA平板上P739平菇菌絲并提取總RNA。以提取的RNA為模板,用Ancheored Oligo(dT)18體系反轉(zhuǎn)錄RNA得到cDNA(具體操作步驟參照TransScript?One-Stepg DNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix說明書)。以cDNA為模板,H1-F/R和H2-F/R引物,分別擴(kuò)增平菇疏水蛋白基因hyd與去除終止密碼子的hyd。擴(kuò)增條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s、61 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,循環(huán)數(shù)為34個(gè),72 ℃ 7 min。分別用BamHⅠ、AsuⅡ和MluⅠ、BamHⅠ雙酶切PCR純化產(chǎn)物,并用Mlu Ⅰ、Asu Ⅱ雙酶切pGEH質(zhì)粒,膠回收雙酶切的產(chǎn)物,并通過酶連反應(yīng)構(gòu)建H-H的表達(dá)載體pEGH-H-H。將pEGH-H-H轉(zhuǎn)化DH5α大腸感受態(tài),用H1-F/R引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,并對(duì)菌落質(zhì)粒進(jìn)行Mlu Ⅰ、Asu Ⅱ雙酶切驗(yàn)證。pEGH-H-H載體圖如圖1所示。提取陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒,將其電擊轉(zhuǎn)化A.tumefaciensEHA105,用H1-F/R引物進(jìn)行菌落PCR檢測。

圖1 pEGH-H-H載體圖Fig.1 pEGH-H-H vector

1.2.3 轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定 通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法將pEGH-H-H載體質(zhì)粒導(dǎo)入到銀耳的基因組中[17]。將含有pEGH-H-H的根瘤農(nóng)桿菌接種到含50 μg/mL 卡那和50 μg/mL利福平的YEB,28 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,吸取120 μL菌液,接種到12 mL上述液體培養(yǎng)基中,28 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600值為0.6～0.8,4 ℃ 5000 r/min離心10 min,棄濾液,用新鮮配制的含有200 μmol/L AS的IM培養(yǎng)基重懸菌體至OD600值約為0.1～0.15,于28 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌毒性,直至菌懸液OD600值為0.6。將銀耳芽孢接種于液體MM培養(yǎng)基中7 d,用IM培養(yǎng)基調(diào)節(jié)孢子濃度為106個(gè)/mL。將已誘導(dǎo)根瘤農(nóng)桿菌菌懸液與銀耳芽孢懸液混合后,涂布于鋪有無菌濾膜的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中,25 ℃培養(yǎng)3 d,將濾膜轉(zhuǎn)接到含有50 μg/mL潮霉素和200 μg/mL頭孢平板上篩選轉(zhuǎn)化子,連續(xù)篩選3代。將所獲得的轉(zhuǎn)化子于無抗PDA培養(yǎng)基中,25 ℃培養(yǎng)7 d,提取DNA,并用H1-F/R和EH-F/R檢測。

擴(kuò)大培養(yǎng)擬轉(zhuǎn)化子,提取其基因組DNA經(jīng)XhoⅠ酶切過夜,以hyd基因作為雜交探針進(jìn)行Southern blot檢測[18]。并提取陽性轉(zhuǎn)化子和野生型銀耳32Y的mRNA交由武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析,檢測引物如表1所示。

1.2.4 目標(biāo)蛋白的提取 按照馬愛民等[19]報(bào)道的方法提取目標(biāo)蛋白。將擬轉(zhuǎn)化子接種于PDA培養(yǎng)基中,25 ℃培養(yǎng)20 d后冷凍干燥,并以野生型平菇P739菌絲作為對(duì)照組,按照料液比1∶10 (m/v)溶解于抽提液I(2% SDS,0.05 mol/L Tris pH6.8)中,100 ℃保持10 min,4000 r/min 離心15 min。所得沉淀溶解于抽提液II(氯仿∶甲酵=2∶1),65 ℃保持10 min,并過濾收集沉淀。向沉淀中加入三氟乙酸溶解,置于冰上放置6 h。所得的樣品經(jīng)十二烷基磺酸鈉―聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析,并采用硝酸銀染色檢測[20]。

1.2.5 疏水蛋白的起泡性和乳化性分析 將銀耳芽孢轉(zhuǎn)化子5號(hào)以及平菇P739的疏水蛋白配制成終濃度為50 μg/mL的樣品,分別取600 μL蛋白溶液,用振蕩混勻儀處理30 s,并在1、3 h 和7 d后取樣進(jìn)行起泡性和乳化性分析[21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)做平行實(shí)驗(yàn)三次，數(shù)值取平均值表示。數(shù)據(jù)采用Oligo 8.0軟件處理。

2 結(jié)果分析

2.1 基因的克隆與序列分析

平菇菌絲總RNA的電泳膠圖如圖2A所示,條帶亮度比表明RNA比較完整,符合要求。疏水蛋白cDNA序列擴(kuò)增結(jié)果如圖2B所示,條帶大小符合預(yù)期且無雜帶,結(jié)合測序結(jié)果表明成功擴(kuò)增平菇疏水蛋白的兩個(gè)片段。

圖2 平菇總RNA與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 Fig.2 Total RNA of P. ostreatus and PCR products 注:A:平菇菌絲總RNA;B:平菇疏水蛋白基因兩個(gè)片段PCR結(jié)果,其中1泳道為去除TAA的hyd基因,2泳道為完整的hyd基因;M:Trans 2K DNA marker。

2.2 表達(dá)載體pEGH-H-H的構(gòu)建

將雙酶切產(chǎn)物和pEGH進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化,用H2-F/R進(jìn)行菌落PCR檢測,如圖3A所示,在330 bp和660 bp的位置都有帶,分別為單一的疏水蛋白基因和融合疏水蛋白基因,與預(yù)期相符。對(duì)pEGH-H-H進(jìn)行MluⅠ、AsuⅡ雙酶切,如圖3B所示,在大約660 bp處有一條明顯的帶,結(jié)果表明,pEGH-H-H載體構(gòu)建成功。

提取pEGH-H-H質(zhì)粒,并電轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌EHA105,H2-F/R引物進(jìn)行菌落PCR檢測,如圖3C所示,在330 bp和660 bp的位置分別有條帶,說明pEGH-H-H質(zhì)粒成功導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中。

圖3 菌落PCR與pEGH-H-H質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證結(jié)果Fig.3 Colony PCR and digestion of pEGH-H-H plasmid注:M:Trans 2K DNA marker;A:泳道1、2 為隨機(jī)挑取含pEGH-H-H質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落PCR結(jié)果;B:泳道1、2為隨機(jī)挑取2個(gè)含pEGH-H-H大腸桿菌的質(zhì)粒雙酶切結(jié)果 C:泳道1～4為隨機(jī)挑取4個(gè)含pEGH-H-H質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌菌落PCR結(jié)果。

2.3 轉(zhuǎn)化子的PCR篩選及驗(yàn)證

通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化將pEGH-H-H載體質(zhì)粒導(dǎo)入到銀耳的基因組中。在潮霉素平板上隨機(jī)挑芽孢轉(zhuǎn)化子,以擬轉(zhuǎn)化子的DNA作模板,分別用EH-F/R和H2-F/R引物進(jìn)行PCR檢測,結(jié)果如圖4所示。其中EH-F/R引物擴(kuò)增的帶大小約為550 bp,H2-F/R在330 bp,660 bp左右都有帶,結(jié)果與預(yù)期相符,表明融合疏水蛋白成功導(dǎo)入到銀耳芽孢中。

圖4 轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 Transformant verification by colony PCR注:A:EH-F/R引物PCR擴(kuò)增結(jié)果,其中泳道1～5為轉(zhuǎn)化子;B:H2-F/R引物PCR擴(kuò)增結(jié)果,其中泳道1為野生型32Y,泳道2～6為擬轉(zhuǎn)化子;M:Trans 2K DNA marker。

2.4 轉(zhuǎn)化子Southern blot分析

選取10個(gè)轉(zhuǎn)化子作Southern blot分析,結(jié)果如圖5所示。5號(hào)芽孢為三拷貝,8號(hào)為雙拷貝轉(zhuǎn)化子,而1、2、10號(hào)為單拷貝轉(zhuǎn)化子,3、4、6、7、9號(hào)轉(zhuǎn)化子未獲得雜交信號(hào),可能為假陽性,也有可能是在第3～5代傳代接種的過程中,部分轉(zhuǎn)化子多次傳代后出現(xiàn)了抗性基因丟失,有研究表明內(nèi)源強(qiáng)啟動(dòng)子有助于維持轉(zhuǎn)化子遺傳性狀的穩(wěn)定表達(dá)[22]。

圖5 轉(zhuǎn)化子Southern雜交結(jié)果Fig.5 Southern blot analysis of transformants 注:M:λ DNA/HindⅢ marker,CK1為陰性對(duì)照32Y芽孢,CK2為陽性對(duì)照載體質(zhì)粒,1～10分別1～10號(hào)轉(zhuǎn)化子。

2.5 轉(zhuǎn)化子real-time PCR分析

選取32Y野生型芽孢和1、5、8、10 號(hào)轉(zhuǎn)化子芽孢進(jìn)行Real-time PCR分析,結(jié)果如圖6所示。其中1、8、5號(hào)均有表達(dá),8號(hào)和5號(hào)表達(dá)量較高,分別為野生型對(duì)照組的5.071倍、11.406倍,結(jié)果與Southern blot分析結(jié)果一致,而1號(hào)可能為假陽性轉(zhuǎn)化子或單拷貝。

圖6 野生型及轉(zhuǎn)化子的實(shí)時(shí)定量檢測結(jié)果Fig.6 Real-time PCR of the wild-type and transformants注:32Y為野生型銀耳芽孢;1、5、8、10為轉(zhuǎn)化子。

2.6 目標(biāo)蛋白的提取及電泳檢測

選取5號(hào)轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng),以P739平菇菌絲為對(duì)照組,利用三氟乙酸法提取目標(biāo)蛋白,SDS-PAGE檢測,如圖7所示。從圖中能明顯看出5號(hào)轉(zhuǎn)化子能提取出目標(biāo)蛋白(箭頭所指),此蛋白的大小與野生型平菇菌絲中的疏水蛋白有明顯差異,約為P739平菇菌絲疏水蛋白的二聚體大小類似,表明平菇融合蛋白在銀耳芽孢中成功表達(dá)。

圖7 純化融合蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.7 SDS-PAGE result of the purified fusion protein注:M為蛋白質(zhì)分子量marker;泳道1為平菇P739菌絲;泳道2為5號(hào)轉(zhuǎn)化子。

2.7 起泡性和乳化性分析

使用振蕩混勻儀處理終濃度為50 μg/mL的平菇P739疏水蛋白溶液和銀耳芽孢5號(hào)轉(zhuǎn)化子的融合疏水蛋白溶液,如表2所示,5號(hào)轉(zhuǎn)化子的蛋白溶液泡沫明顯高于平菇P739的蛋白溶液泡沫,且在一周后泡沫仍然保持一定高度。從表3可知,5號(hào)轉(zhuǎn)化子蛋白溶液的乳化指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)均高于SDS。由此可見,5號(hào)轉(zhuǎn)化子疏水蛋白溶液的性質(zhì)比平菇的疏水蛋白溶液有一定程度的提升。

表2 起泡性和泡沫穩(wěn)定性Table 2 Foamability and foam stability

表3 乳化性及乳化穩(wěn)定性Table 3 Emulsibility and emulsion stability

3 結(jié)論

本研究通過雙酶切酶連方法,構(gòu)建融合疏水蛋白基因H-H,并利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法將其成功導(dǎo)入到銀耳芽孢中。Southern雜交驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化子中存在單拷貝、雙拷貝和多拷貝等不同的插入情況。實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示,高拷貝轉(zhuǎn)化子中的疏水蛋白相對(duì)含量要比單拷貝高,該結(jié)果與Southern雜交結(jié)果一致。

5號(hào)轉(zhuǎn)化子疏水蛋白的相對(duì)表達(dá)量最高,為野生型的11.4倍。蛋白溶液起泡性和乳化性比較發(fā)現(xiàn),5號(hào)轉(zhuǎn)化子融合疏水蛋白的性質(zhì)稍優(yōu)于平菇疏水蛋白,其原因可能與融合疏水蛋白中二硫鍵的數(shù)量較平菇疏水蛋白提高有關(guān)。