仙鶴草中齊墩果酸類皂苷的提取工藝研究①

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(1.佳木斯市中心醫(yī)院藥劑科，黑龍江 佳木斯 154002;2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，黑龍江 佳木斯 154007)

0 引 言

仙鶴草在我國資源豐富，但是藥用開發(fā)多處于初級(jí)階段，集中在其化學(xué)成分及活性上，化學(xué)成分方面以小極性分子為主，極性較大的鞣質(zhì)類、三萜皂苷類和黃酮苷類等研究較少，較少見到對(duì)單一化合物活性的研究；仙鶴草活性方面的研究多集中在抗腫瘤、抗氧化等，但是大多數(shù)作用機(jī)制研究還不深入，結(jié)合藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的構(gòu)效關(guān)系研究亦少見，這大大限制了仙鶴草的臨床應(yīng)用及新藥研發(fā)。

仙鶴草Agrimonia pilosa Ledeb，薔薇科龍芽草屬植物龍芽草的全草，又名馬鞭草，其性平味苦澀，歸心、肝經(jīng)，具有收斂止血等功效，臨床主要用于治療咯血、崩漏下血、脫力勞傷等[1,2]?，F(xiàn)代研究證明其富含多糖、三萜皂苷，黃酮，有機(jī)酸和揮發(fā)油等[3～5]。藥理實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)仙鶴草具有降血糖、抗病毒、抗腫瘤、抗炎和抗菌等藥理活性[6]。

齊墩果酸(OleanolicAcid,OLA)，五環(huán)三萜類化合物，其結(jié)構(gòu)式為：

OLA是廣泛地存在于食物、醫(yī)學(xué)草本植物和其他植物中，其毒性很低，生物活性豐富[7,8]：抗病毒、降血脂、降血糖和抗艾滋病毒等，藥用價(jià)值較大。旨在篩選超聲波提取仙鶴草中齊墩果酸類皂苷的最佳參數(shù)及其水平，最大化提取齊墩果酸，為該植物中三萜皂苷類成分的充分利用與深入的藥理研究奠定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器、材料和試劑

紫外可見分光光度計(jì)(UV757CRT型)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52A型)；恒溫電熱套(DRT-SX型)；電子分析天平；醫(yī)用數(shù)控超聲波提取器；恒溫水浴鍋。

仙鶴草購買于佳木斯市。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品(金測(cè)分析技術(shù)有限公司)；冰醋酸，三氯甲烷，濃硫酸，95%乙醇，環(huán)已烷，乙酸乙酯，無水乙醇，甲醇(色譜純)，硅膠G(薄層色譜)，未標(biāo)明的均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 齊墩果酸類皂苷的含量測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測(cè)溶液的配制

取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇制成濃度為0.2g/mL的溶液，精密移取標(biāo)準(zhǔn)溶液于具有塞比色管中，加入濃H2SO42mL，搖勻，80℃水浴加熱30min，取出后放入冰浴中冷卻，加入適量甲醇，定容至10 mL，即得標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照溶液。4℃，放置，備用。

仙鶴草各種提取液，依上述方法配制待測(cè)液。

2.1.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定

以H2SO4-CH3OH溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%)為空白對(duì)照，于波長(zhǎng)200-400nm之間掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取10mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，減壓蒸餾，然后加入20mL濃H2SO4，搖勻，水浴加熱30min，冷卻，精密移取待測(cè)液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6 mL，分別置于8個(gè)具塞比色管中，采用甲醇定容至10 mL，靜置，以梯度濃度H2SO4-CH3OH溶液作為空白對(duì)照，于所確定的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)皂苷提取的影響。

稱取10g 仙鶴草粉末5份，分別加入體積分?jǐn)?shù)為60%,70%,80%,95%,100%的乙醇溶液各120mL，超聲波提取20min，取濾液濃縮至約50 mL，用移液管取1 mL定容至100 mL，用移液管取1 mL在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定皂苷含量(測(cè)定方法下同)。

2.2.2 料液比對(duì)皂苷提取的影響。

稱取10g仙鶴草粉末5份，分別加入80,100,120,200,250 mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液，超聲提取后進(jìn)行含量測(cè)定。

2.2.3 超聲提取時(shí)間對(duì)皂苷提取的影響。

稱取10g仙鶴草粉末5份，分別加入120mL 95%的乙醇溶液，超聲提取0,15，20，25,30 min后進(jìn)行含量測(cè)定。

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)皂苷提取的影響

稱取10g仙鶴草粉末4份，分別加入120mL95%的乙醇溶液，提取1次、2次、3次、4次后進(jìn)行含量測(cè)定。

2.2.5 溫度對(duì)皂苷提取的影響

稱取10g仙鶴草粉末5份，分別加入120mL 95%的乙醇溶液，在50℃,60℃,70℃,80℃,90℃恒溫水浴中超聲波提取20min后進(jìn)行含量測(cè)定。

2.3 正交試驗(yàn)

進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過實(shí)驗(yàn)確定影響超聲波提取仙鶴草中齊墩果酸類皂苷的主要因素及水平。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 齊墩果酸溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)設(shè)計(jì)方法，確定齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的回歸方程為y= 41.914x(R2=0.9707)，結(jié)果見圖1。皂苷標(biāo)準(zhǔn)液濃度在2～16μg/mL時(shí)呈線性關(guān)系。

圖1 齊墩果酸溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 乙醇濃度對(duì)超聲波提取齊墩果酸類皂苷的影響

圖3 料液比對(duì)超聲波提取齊墩果酸類皂苷的影響

3.2 單因素試驗(yàn)

乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為95%時(shí)，皂苷的提取量最大，結(jié)果見圖2；料液比(g：mL)達(dá)到1 1:20，皂苷提取較完全，結(jié)果見圖3；提取時(shí)間為20min時(shí)，含量最大，結(jié)果見圖4；提取次數(shù)為2次時(shí)，吸光值達(dá)到最大，結(jié)果見圖5；溫度為70℃時(shí)，吸光值達(dá)到最大值，結(jié)果見圖6。

3.3 正交試驗(yàn)

通過正交試驗(yàn)可知，影響超聲波提取仙鶴草中齊墩果酸類皂苷提取率的主要因素及大小順序是D>C>B>A，即料液比、超聲波提取時(shí)間、溫度、乙醇濃度。其中7號(hào)試驗(yàn)(A3B1C3D2)提取率最大，為8.4%，實(shí)驗(yàn)條件為乙醇濃度100%，超聲溫度60℃，超聲時(shí)間25 min，料液比1:12。結(jié)果見表1。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果

圖4 超聲時(shí)間對(duì)超聲波提取齊墩果酸類皂苷的影響

圖5 超聲提取次數(shù)對(duì)超聲波提取齊墩果酸類皂苷的影響

圖6 提取溫度對(duì)超聲波提取齊墩果酸類皂苷的影響

4 結(jié) 語

以極性較大的皂苷類為研究對(duì)象，對(duì)仙鶴草中齊墩果酸皂苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化篩選，旨在為深入開展其中同類皂苷類研究奠定提取方面的理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步完成活性及其機(jī)制研究提供物質(zhì)來源。通過實(shí)驗(yàn)可知，仙鶴草中皂苷含量較豐富，作為藥用植物具有開發(fā)價(jià)值；實(shí)驗(yàn)得出的以齊墩果酸為主的皂苷類化合物的提取工藝簡(jiǎn)便易行，提取率高，值得推廣。