DON、ZEA聯(lián)合染毒對(duì)體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的影響

張 卓，辜彥霏，陽(yáng)莎莎，王亞超，鄧俊良，任志華*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2.西南科技大學(xué)，四川 綿陽(yáng) 621010)

鐮刀菌毒素是導(dǎo)致全球食品、飼料業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最大的一組霉菌毒素[1]。與家畜健康和生產(chǎn)有關(guān)的重要的鐮刀菌毒素是單端孢霉烯族毒素，即脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，玉米赤霉烯酮(ZEA)，T-2毒素和煙曲霉毒素。由于家禽對(duì)鐮刀菌毒素敏感性明顯低于豬，因此家禽鐮刀菌毒素中毒常表現(xiàn)亞臨床癥狀而容易被忽視。霉菌毒素性質(zhì)穩(wěn)定，在糧食的儲(chǔ)存和加工過(guò)程中不易被破壞，因此極易通過(guò)食物鏈引起人畜中毒[2]。

細(xì)胞因子可傳遞細(xì)胞間信息進(jìn)而參與免疫應(yīng)答全過(guò)程，其在免疫調(diào)控中起重要作用。國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者對(duì)DON、ZEA單獨(dú)染毒對(duì)脾臟細(xì)胞因子的影響進(jìn)行了大量研究，結(jié)果表明，DON、ZEA單獨(dú)染毒均對(duì)細(xì)胞因子的分泌、基因表達(dá)有影響。Kinser等[3]利用芯片研究小鼠口服 25 mg·kg-1體質(zhì)量的DON對(duì)其脾臟調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用，結(jié)果表明DON主要與免疫調(diào)節(jié)、炎癥有關(guān)的基因和趨化因子有關(guān)，主要誘導(dǎo)IL-1α、IL-1β、IL-6和IL-11的分泌。Pestka等[4]給斷奶小鼠和成年小鼠以5 mg·kg-1體質(zhì)量的劑量口服DON，結(jié)果DON影響了脾臟的INF-α、IL-1β和IL-6，其mRNA的表達(dá)斷奶小鼠是成年小鼠的2～3倍。Marin等[5]研究ZEA對(duì)豬的中性粒細(xì)胞的免疫反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖減少，IL-8顯著減少。

目前飼料受鐮刀菌毒素污染非常嚴(yán)重，尤其在四川等南方潮濕、多雨、日照短的亞熱帶濕潤(rùn)氣候地區(qū)，DON和ZEA在飼料中的檢出率均嚴(yán)重超標(biāo)[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)以原代培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞為模型，重點(diǎn)研究了DON、ZEA聯(lián)合染毒對(duì)雞脾淋巴細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的影響，為進(jìn)一步闡明動(dòng)物DON、ZEA中毒機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

40～60日齡健康的伊莎公雞，購(gòu)自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。無(wú)菌摘取雞脾臟，放入裝有PBS液的培養(yǎng)皿中，清洗后剝離脾臟周圍結(jié)締組織。移至盛有PBS液培養(yǎng)皿中200目的銅網(wǎng)上，用無(wú)菌的注射器內(nèi)芯研磨，使脾臟淋巴細(xì)胞進(jìn)入PBS液中，過(guò)濾，并稀釋濾液到一定濃度。再將此細(xì)胞懸液緩慢移入裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，2 000 r·min-1，常溫離心15 min后移取淋巴細(xì)胞。將淋巴細(xì)胞用冷的PBS液和不含毒素含血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液各洗滌1次，重懸，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，細(xì)胞活力大于95%可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

CCK-8法分別檢測(cè)了DON、ZEA致雞脾臟淋巴細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50)，DON的IC50為(30.82±10.48) μg·mL-1，ZEA的IC50為(23.91±4.96) μg·mL-1。前期實(shí)驗(yàn)中DON、ZEA單獨(dú)染毒時(shí)高濃度均造成脾臟淋巴細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷，故在正式試驗(yàn)中以DON、ZEA低濃度進(jìn)行聯(lián)合染毒。DON、ZEA聯(lián)合染毒劑量為0.012 5 μg·mL-1和0.006 25 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1和0.025 μg·mL-1、0.2 μg·mL-1和0.1 μg·mL-1、0.8 μg·mL-1和0.4 μg·mL-1，分別設(shè)為DZ-1組、DZ-2組、DZ-3組和DZ-4組。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

胎牛血清(FBS)(Gibco，美國(guó))，Hepes、DON、ZEA及無(wú)酚紅的RPMI1640培養(yǎng)基(Sigma，美國(guó))，細(xì)胞計(jì)數(shù)(CCK-8)試劑盒(DOJINDO，日本)，rTaq酶等PCR反應(yīng)試劑(TaKaRa，日本)，Trizol試劑盒、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，美國(guó))，溴化乙錠(EB)(美國(guó)Sigma)，雞的IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒(上海生物公司，中國(guó))。

1.3 體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ含量的測(cè)定

染毒48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3 000 r·min-1離心20 min，吸取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩０凑f(shuō)明書(shū)測(cè)定上清液中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的含量。

1.4 體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ mRNA的表達(dá)測(cè)定

采用熒光定量RT-PCR法測(cè)定，淋巴細(xì)胞低溫充分勻漿后，用Trizol試劑抽提總RNA，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank中發(fā)表的雞的全基因序列，應(yīng)用Prime 5.0軟件設(shè)計(jì)特異的上、下游引物，使用GenBank Blast同源性檢索后由Invitrogen公司(上海)合成。IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和β-actin的引物序列及參數(shù)見(jiàn)表1。在30 μL體系中進(jìn)行擴(kuò)增：10 μL總RNA，1 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，1 μL RNA酶抑制劑，4 μL dNTP，2 μL Oligo dT，4 μL DTT和8 μL 5×buffer。42 ℃，反應(yīng)30 min，99 ℃滅活5 min，5 ℃ 5 min。RT產(chǎn)物瞬時(shí)離心，立即使用或保存在-20 ℃?zhèn)溆?。上述各?xiàng)指標(biāo)的測(cè)定重復(fù)3個(gè)不同批次的細(xì)胞，每批細(xì)胞每個(gè)樣本重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。采用REST軟件分析毒素處理樣品各目的基因mRNA表達(dá)豐度的差異并計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 DON、ZEA聯(lián)合染毒對(duì)雞脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ含量的影響

DON、ZEA聯(lián)合染毒對(duì)上清液中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ含量的影響，見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，染毒48 h，隨毒素濃度的升高，雞脾臟淋巴細(xì)胞上清液中IL-10和IFN-γ蛋白含量均升高，蛋白含量除IL-10和IFN-γ在DZ-1組外，均顯著或極顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)；而隨毒素濃度的升高，IL-2和IL-4蛋白含量降低，除IL-2、IL-4在DZ-1組、IL-2在DZ-2組外，均顯著或極顯著低于空白對(duì)照組(P<0.01)。DON、ZEA聯(lián)合染毒48 h，除IL-4在DZ-3與DZ-4間，IFN-γ在DZ-2與DZ-3 (DZ-1組)間外，其余各組組間差異顯著或極顯著(P<0.01)。由此表明，DON、ZEA聯(lián)合染毒可導(dǎo)致雞脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10和IFN-γ蛋白含量隨毒素濃度的升高而增加，IL-2和IL-4蛋白含量均隨毒素濃度的升高而降低，具有顯著的劑量依賴關(guān)系。

表1 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和β-actin基因的引物設(shè)計(jì)

表2 DON、ZEA聯(lián)合對(duì)雞脾臟淋巴細(xì)胞上清液中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ含量的影響

同列數(shù)據(jù)上沒(méi)有相同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

In the same column， values without the same capital letters mean that the difference is significant (P<0.01). The same as below.

2.2 DON、ZEA聯(lián)合染毒對(duì)雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的mRNA表達(dá)的影響

DON、ZEA聯(lián)合作用對(duì)雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ基因的mRNA的表達(dá)，見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，DON、ZEA聯(lián)合染毒48 h，除IL-10在DZ-1組，雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)IL-2、IL-4和IL-10 mRNA表達(dá)量均隨毒素濃度的升高而升高，極顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)；IFN-γ的mRNA表達(dá)量呈先升高后降低趨勢(shì)，但均極顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)。DON、ZEA聯(lián)合染毒48 h，除IL-10在DZ-1組與空白對(duì)照組間，其余各組組間差異極顯著(P<0.01)。由此表明，DON、ZEA聯(lián)合染毒可導(dǎo)致雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)IL-2、IL-4和IL-10 mRNA表達(dá)量隨毒素濃度的升高而增加，具有顯著的劑量依賴關(guān)系；IFN-γ mRNA表達(dá)量隨毒素濃度的升高而先升高后降低。

表3 DON、ZEA聯(lián)合染毒對(duì)雞脾臟淋巴細(xì)胞調(diào)控基因IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ mRNA的表達(dá)

3 討論

DON、ZEA均可破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)造成免疫抑制，它們作用于免疫系統(tǒng)的主要靶器官是脾臟。但目前它們對(duì)雞脾臟功能影響的研究主要集中在脾臟相對(duì)質(zhì)量、組織病理學(xué)改變方面，對(duì)細(xì)胞因子的影響多是單獨(dú)毒素染毒的研究，而兩種毒素聯(lián)合染毒對(duì)雞脾臟淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)研究DON、ZEA對(duì)雞脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響，即Thl細(xì)胞因子(IL-2和IFN-γ)和Th2細(xì)胞因子(IL-4和IL-10)在體外培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞的上清液中的分泌含量和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子基因的mRNA的表達(dá)。

ZEA誘導(dǎo)人和小鼠的幾個(gè)免疫指標(biāo)改變，即增加IL-2和IL-5的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)免疫抑制作用[13-15]。ZEA誘導(dǎo)老年鼠分泌的IFN-γ減少[16]。范小龍等[17]采用ELISA的方法測(cè)定ZEA對(duì)離體培養(yǎng)的小鼠淋巴細(xì)胞因子IFN-γ和1L-10分泌的影響，結(jié)果表明低濃度ZEA(1 μg·mL-1)能顯著促進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞分泌IL-l0，而高濃度ZEA(10、25 μg·mL-1)能極顯著抑制脾臟淋巴細(xì)胞分泌lL-10，不同濃度ZEA均能顯著或極顯著抑制脾臟淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果部分類似，但因不同動(dòng)物對(duì)DON、ZEA的敏感性存在種屬差異。所以，目前研究結(jié)果與以往的研究結(jié)果可能也會(huì)有差異。

目前單一DON或ZEA對(duì)細(xì)胞因子的影響報(bào)道較多見(jiàn)，而DON和ZEA聯(lián)合染毒對(duì)細(xì)胞因子影響的報(bào)道較少見(jiàn)。Ren等[18-19]分別報(bào)道了DON和ZEA聯(lián)合染毒可降低小鼠血清IL-4和IFN-γ的濃度。在我們的實(shí)驗(yàn)中，隨著DON和ZEA聯(lián)合毒素濃度的增加，雞脾臟淋巴細(xì)胞分泌的IL-4的濃度和mRNA的表達(dá)量都是下降的；細(xì)胞分泌的IFN-γ的濃度雖然升高，但mRNA的表達(dá)量先升高后下降，預(yù)測(cè)試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)后濃度也會(huì)下降?？傮w上，DON和ZEA聯(lián)合染毒對(duì)雞脾臟淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響和Ren等[18-19]報(bào)道的DON和ZEA聯(lián)合染毒對(duì)小鼠血清細(xì)胞因子影響的趨勢(shì)相一致。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DON、ZEA聯(lián)合染毒雞脾淋巴細(xì)胞上調(diào)或下降促炎性細(xì)胞因子的水平。Th1和Th2細(xì)胞因子平衡失調(diào)，因此造成細(xì)胞免疫損傷，進(jìn)而產(chǎn)生毒性。