激光拉曼光譜無損分析浙貝母

孫彩霞，潘志彥，戴 芬，鄭蔚然，于國光

(1.農業(yè)農村部農產品信息溯源重點實驗室，浙江省農業(yè)科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州310021； 2.浙江工業(yè)大學 環(huán)境學院，浙江 杭州 310032)

浙貝母是著名的中藥材“浙八味”之一，野生浙貝母多生長在林蔭處，現(xiàn)多為栽培。浙貝母主要分布于浙江、江蘇、安徽、湖南等地，浙江的浙貝母產量最大，主要分布于寧波鄞州區(qū)和海曙區(qū)、東陽市、縉云縣、磐安縣、舟山市定海區(qū)等地，其中寧波鄞州區(qū)和海曙區(qū)為浙貝母的原產地。根據《中國藥典》記載，浙貝母具有清熱化痰止咳，解毒散結消癰等作用，用于治療風熱咳嗽、痰火咳嗽、肺癰、乳癰、瘰疬、瘡毒[1]。

激光拉曼光譜是一種散射光譜，通過與入射光頻率不同的散射光譜進行分析以得到分子振動、轉動方面信息，并應用于分子結構研究的一種分析方法[2-3]。拉曼效應產生于來自高能量的入射光子與樣品分子振動能級之間的能量交換，產生拉曼位移。拉曼位移的程度對應于分子振動能級的躍遷。在有機物結構分析中，拉曼光譜適用于對稱的鍵，如C—C，C=C，C≡C，N—N，S—S等，這些鍵在紅外吸收很弱，但在拉曼散射中很強。拉曼光譜在成分分析中最大的優(yōu)勢是可以實現(xiàn)產品的無損分析和定量/定性檢測，相對于現(xiàn)有的光譜、質譜、紅外等分析方法，具有無需或者便于前處理，檢測后的產品可以回收利用等優(yōu)勢。

藥材含有豐富的官能團，一方面既與藥材本身豐富的有機物有關，另一方面也與藥材的產地有關。近年來，采用拉曼光譜用于對中藥材產品的真?zhèn)舞b別和道地性分析比較多見，但用于浙貝母的分析比較少。本研究通過采集浙江省主要浙貝母產地的樣品，進行激光拉曼光譜分析，初步建立浙貝母的拉曼光譜圖譜，實現(xiàn)應用拉曼光譜技術無損、快速、準確、簡便地鑒別浙貝母的目的，為拉曼光譜在浙貝母等中藥材中的分析應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

浙貝母樣品分別取自寧波市海曙區(qū)章水鎮(zhèn)、東陽市、縉云縣、磐安縣、舟山市定海區(qū)等5個浙貝母主產區(qū)生產基地。樣品采集時間為2017年5月份，為浙貝母采收季節(jié)。根據生產基地面積大小，每個基地采集1～3個新鮮樣品，每個樣品質量為500 g，共采集樣品47個，主要樣品的分布情況見表1。

樣品采用隨機取樣法采集，采集后的新鮮浙貝母種球用紙巾輕輕擦拭除去泥土后，裝入潔凈的塑料采樣袋中，放入冰箱4 ℃冷藏保存。

1.2 儀器與方法

采用共聚焦拉曼光譜儀(HR800 Lab RAM，Horiba JobinYvon)及配套設備組成。光譜儀配備531.95 nm激光光源(frequency-doubled Nd∶YAG，20 mW)及CCD(charge coupled device)檢測器(multichannel，air cooled)。光譜測量范圍200～4 000 cm-1，曝光時間120 s。

選擇表明平整，大小均勻干凈的浙貝母新鮮種球，采用手術刀切片，選取切片均勻的切片，放置于載玻片上，使其位于激光顯微拉曼光譜儀載物臺的物鏡視野下，通過微機屏幕上的影像窗口調整焦距，測定浙貝母新鮮樣品表面的拉曼光譜。

2 結果與討論

2.1 不同產地浙貝母的拉曼光譜

根據不同產地采集的浙貝母拉曼位移，去除部分樣品差異比較大的樣品，不同產地浙貝母的拉曼光譜位移見圖1。

浙貝母富含糖類及生物堿，由于其不同的產地和品種，形成的產品中微量元素和有效成分含量的差異，形成不同產地浙貝母的拉曼光譜的指紋圖譜。對比圖1各圖，可以看出，不同產地的浙貝母樣品在475～500、2 800～2 900 cm-1呈現(xiàn)明顯的位移。在800～2 000 cm-1處，不同產地的浙貝母拉曼光譜的位移有所差異。浙貝母可能含有D-葡萄糖、氨基葡萄糖、氘代氨基葡萄糖、氘代N-乙?；咸烟恰? 800～2 900 cm-1的位移為—C—H的伸縮震動，475～500 cm-1的位移為Si—O鍵的位移和D-葡萄糖。而在2 000～2 800 cm-1，由于熒光干擾，使得這一段的信噪比非常低[4-5]。

2.2 拉曼光譜一階導數圖譜

根據2.1節(jié)的分析，5個不同產地的拉曼光譜在800～2 000 cm-1處，不同產地的浙貝母拉曼光譜的位移差異比較大，因此選擇這一階段的拉曼光譜進行一階求導，不同產地浙貝母的一階導數圖譜見圖2。不同產地的浙貝母出現(xiàn)拉曼特征峰的位置比較相似，在875、912、965、1 153、1 312、1 410、1 482、1 598、1 641 cm-1位移處出現(xiàn)明顯的特征峰，在985、1 025、1 056、1 096、1 112、1 239、1 356、1 378、1 432、1 629、1 692 cm-1位移處出現(xiàn)較為明顯的特征峰。

圖1 寧波市海曙區(qū)(A)、東陽市(B)、縉云縣(C)、磐安縣(D)和舟山市定海區(qū)(E)浙貝母拉曼光譜圖Fig.1 Raman spectroscopic of Thunberg Fritillary Bulb from Haishu District of Ningbo City， Dongyang City， Jinyun County， Pan’an County and Dinghai District of Zhoushan City

圖2 不同產地浙貝母拉曼位移的一階導數Fig.2 First-order derivative of Raman spectroscopic of Thunberg Fritillary Bulb from different sources

2.3 浙貝母拉曼位移的歸屬

對比浙江省不同產地和批次的浙貝母的拉曼光譜位移圖譜，以及不同種植區(qū)域浙貝母拉曼位移的一階導數圖譜，可知浙貝母新鮮種球的拉曼光譜非常穩(wěn)定，在800～2 000 cm-1位移處的特征峰比較豐富。不同產地的浙貝母在475～500、2 000～2 800 cm-1以及875、912、965、1 153、1 312、1 410、1 482、1 598、1 641 cm-1位移處出現(xiàn)明顯的特征峰。查閱文獻初步得知這9處特征峰的歸屬[6-7]。

浙貝母的9個拉曼位移中，875 cm-1處的位移初步歸屬為甲基C—C鍵振動，912 cm-1處的位移初步歸屬為面外C—H變形振動，965 cm-1處的位移初步歸屬為環(huán)“呼吸”對稱伸縮振動，1 153 cm-1處的位移初步歸屬為C—C(=O)—C反對稱伸縮振動，1 312 cm-1處的位移初步歸屬為咪唑環(huán)伸縮振動，1 410 cm-1處的位移初步歸屬為甲酰基環(huán)伸縮，1 482和1 589 cm-1處的位移初步歸屬為C=C伸縮振動。通過這些官能團振動，可判斷出浙貝母內所含成分，從而達到成分分析研究的目的。在不同波長處拉曼光譜的位移強度與所含成分的濃度有關，這可能由于不同產地的浙貝母生長環(huán)境及品種不同的差異所致，但拉曼光譜用于浙貝母有效成分含量的定量研究還缺乏數據支持，可以借助進一步的色譜或質譜分析進行。通過上述分析，可以初步判定浙貝母在800～2 000 cm-1位移處的9個特征峰作為浙貝母的特征圖譜，作為判定這類產品的信息。

2.4 拉曼光譜在農產品無損檢測分析中的應用

拉曼光譜用于農產品檢測分析，具有免于樣品前處理和無損分析的特點，檢測方法快速、簡便，樣品可以回收利用，在高端農產品分析中具有良好的應用前景。現(xiàn)有的研究結果表明，拉曼光譜用于分析棕櫚油、靈芝孢子油等農產品是否以次充好、以假亂真方面的研究已有報道[9-10]。拉曼光譜的特征位移是對被測物質進行定性檢測的依據，由于每種物質含有的特征官能團對應的拉曼光譜位移缺少豐富的數據庫資源，因此拉曼光譜在物質的鑒別方面缺少豐富的數據庫支持，有待于充分積累特色農產品的拉曼光譜信息，作為該類物質進行拉曼光譜分析的依據。

3 結論

拉曼光譜具有無損、快速、準確、簡便，以及免于前處理和所用樣品易于回收的特點而廣泛應用于農產品檢測[8]。拉曼光譜當前已成功應用于快速鑒別藥材類別、真?zhèn)?、?yōu)劣及產地溯源等方面，但在浙貝母中的應用比較少。本研究首次將拉曼光譜用于浙貝母新鮮樣品的檢測，分析了浙江省浙貝母主產區(qū)的拉曼光譜，對比了同樣產區(qū)不同生產基地和不同生產地區(qū)的浙貝母新鮮樣品拉曼光譜的差異，為拉曼光譜用于浙貝母的檢測分析提供了一定的實驗依據。該方法亦可進一步拓展成為鑒別浙貝母真?zhèn)渭爱a地溯源的手段。但需要更多的樣品和分析方法的支持[11-12]。