鹽脅迫條件下楊樹bZIP轉(zhuǎn)錄因子全基因組分析

王升級，孫赫，黨慧

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西 太谷 030801；2.國家林業(yè)和草原局，北京 100714)

植物在生長發(fā)育過程中常受到干旱、低溫、鹽堿、蟲害等不同生物及非生物因子的影響。為適應(yīng)多變的環(huán)境，植物體內(nèi)大量脅迫相關(guān)的基因被誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)抗逆相關(guān)蛋白得到積累[1]。轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)又稱為反式作用因子，在植物應(yīng)答逆境脅迫生物學(xué)過程中起到開關(guān)的作用，能夠通過調(diào)控目的功能基因的表達(dá)提高植物的抗逆性[2]。bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。bZIP轉(zhuǎn)錄因子一般包含一個(gè)高度保守的bZIP結(jié)構(gòu)域。在bZIP保守結(jié)構(gòu)域外往往還含有起轉(zhuǎn)錄激活作用的脯氨酸富集區(qū)和谷氨酸富集區(qū)[3]。該轉(zhuǎn)錄因子家族成員在植物種子成熟萌發(fā)、花器官發(fā)育、激素和光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、ABA脅迫誘導(dǎo)等生物及非生物脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要的作用。尤其在植物的應(yīng)激反應(yīng)和激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，bZIP轉(zhuǎn)錄因子通過與ABRE作用元件(ABA responsive element)結(jié)合調(diào)控目的靶基因的表達(dá)[4]。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的特點(diǎn)，bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族常被分為A、B、C、D、E、F、G、H、I、S等不同的亞族[5]。擬南芥AtbZIP39轉(zhuǎn)錄因子基因參與ABA脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并且能夠通過調(diào)控LEA基因的表達(dá)參與種子萌發(fā)過程[6,7]；玉米bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因Opaque2與PBF蛋白互作調(diào)控種子貯藏蛋白的合成[8]。轉(zhuǎn)錄因子基因AtbZIP57/OBF4/TGA4通過參與水楊酸或者乙烯合成途徑應(yīng)答植物病原侵染反應(yīng)。在應(yīng)對病原體攻擊反應(yīng)中，植物體內(nèi)的水楊酸誘導(dǎo)抗病相關(guān)基因的表達(dá)，TGA元件能夠與抗病相關(guān)基因啟動(dòng)子中的as-1順式作用元件結(jié)合進(jìn)而提高植物的抗病能力[9,10]。近年來，關(guān)于草本植物及農(nóng)作物中bZIP轉(zhuǎn)錄因子的研究報(bào)道較多，而涉及木本植物楊樹的研究較為少見。自2004年楊樹基因組測序完成以后，伴隨分子生物學(xué)及生物信息學(xué)的發(fā)展，楊樹已經(jīng)被廣泛用作研究林木分子育種及逆境抗性育種的模式植物[11]。

本研究為明確楊樹bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)構(gòu)特征和在應(yīng)答鹽脅迫過程中的作用機(jī)制，通過生物信息學(xué)分析獲得楊樹bZIP轉(zhuǎn)錄因子214個(gè)，分析其序列及蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)特征；鹽脅迫條件下，利用轉(zhuǎn)錄組測序分析其鹽脅迫條件下表達(dá)模式，鑒定出應(yīng)答鹽脅迫bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因19個(gè)，為楊樹耐鹽關(guān)鍵基因篩選及bZIP轉(zhuǎn)錄因子功能研究提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

將4周大小的無菌組織培養(yǎng)84 K楊樹(Populusalba×P.glandulosa)幼苗置于溫室內(nèi)水培，溫室溫度控制在24 ℃左右，光照時(shí)間為14 h·d-1。約4周后，選取長勢相似且健壯的植株分為對照組(W1，W2，W3，W4)與試驗(yàn)組(S1，S2，S3，S4)二組，每組設(shè)置生物學(xué)重復(fù)4次。對照組與實(shí)驗(yàn)組分別用水和150 mmol·L-1NaCl 溶液處理24 h。處理后分別采集對照與試驗(yàn)組的楊樹幼苗葉片組織，液氮中迅速冷凍后于-80 ℃超低溫冰箱中保存以備總RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序使用。

1.2 試驗(yàn)方法

利用生物信息學(xué)分析方法從PlantTFDB(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php)數(shù)據(jù)庫檢索到楊樹bZIP轉(zhuǎn)錄因子214條，命名為PtbZIP1- PtbZIP214。分別利用軟件ClustalX 1.83和MEGA 7.0 進(jìn)行保守域氨基酸序列比對分析及進(jìn)化樹的構(gòu)建(Bootstrap：1000)。利用軟件DNAMAN 6.0預(yù)測楊樹bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族二級結(jié)構(gòu)。

RNA-seq由金唯智(GENEWIZ)測序服務(wù)公司完成。其測序文庫構(gòu)建過程包括：RNA質(zhì)量檢測；文庫構(gòu)建；文庫純化；文庫檢測；文庫定量分析；cBOT 自動(dòng)成簇。檢測合格后，按照有效濃度及測序需求混樣后進(jìn)行Illumina Hiseq2500測序。

RNA-seq 數(shù)據(jù)分析過程包括：利用軟件Fastqc檢測測序數(shù)據(jù)質(zhì)量；移除多余接頭以獲得高純度質(zhì)量序列片段；利用軟件Tophat將序列片段與楊樹參照基因組進(jìn)行比對；利用軟講Cufflinks將比對成功的序列片段進(jìn)行拼接并量化基因表達(dá)量?；虮磉_(dá)量以每百萬條成功比對的序列中每1 000 bp轉(zhuǎn)錄組含有的序列片段數(shù)量(Fragments per kilo-base Transcript per million mapped reads, FPKM)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

本文利用單因素變量分析方法t檢測比較試驗(yàn)處理前后各基因表達(dá)水平的差異，其中P≤0.05的定義為差異表達(dá)基因；利用無監(jiān)督聚類方法(unsupervised clustering analysis)對表達(dá)模式相似的差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析處理均由R軟件(http://cran.r-project.org/)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族比對分析

利用生物信息學(xué)分析方法獲得214個(gè)楊樹bZIP轉(zhuǎn)錄因子(表1)，參照擬南芥bZIP轉(zhuǎn)錄因子分類方法，根據(jù)楊樹bZIP轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對結(jié)果，將其分為11個(gè)亞族：A(PtbZIP122、PtbZIP163、PtbZIP164)、B(PtbZIP115、PtbZIP201、PtbZIP202)、C(PtbZIP28、PtbZIP29、PtbZIP30、PtbZIP92、PtbZIP109、PtbZIP127、PtbZIP128、PtbZIP129、PtbZIP130、PtbZIP131、PtbZIP132、PtbZIP133、PtbZIP134、PtbZIP176、PtbZIP177、PtbZIP178、PtbZIP179、)、D(PtbZIP4、PtbZIP5、PtbZIP6、PtbZIP7、PtbZIP8、PtbZIP9、PtbZIP10、PtbZIP11、PtbZIP12、PtbZIP13、PtbZIP34、PtbZIP35、PtbZIP36、PtbZIP37、PtbZIP53、PtbZIP54、PtbZIP55、PtbZIP56、PtbZIP57、PtbZIP58、PtbZIP59、PtbZIP60、PtbZIP61、PtbZIP86、PtbZIP87、PtbZIP88、PtbZIP89、PtbZIP93、PtbZIP94、PtbZIP95、PtbZIP96、PtbZIP97、PtbZIP102、PtbZIP103、PtbZIP104、PtbZIP116、PtbZIP117、PtbZIP118、PtbZIP119、PtbZIP120、PtbZIP121、PtbZIP140、PtbZIP141、PtbZIP142、PtbZIP150、PtbZIP151、PtbZIP161、PtbZIP162、PtbZIP170、PtbZIP203、PtbZIP204)、E(PtbZIP22、PtbZIP23、PtbZIP24、PtbZIP25、PtbZIP181、PtbZIP211、PtbZIP212)、F(PtbZIP2、PtbZIP3、PtbZIP62、PtbZIP63、PtbZIP78、PtbZIP79、PtbZIP80、PtbZIP81、PtbZIP82、PtbZIP83、PtbZIP84、PtbZIP85、PtbZIP157、PtbZIP158、PtbZIP159、PtbZIP160)、G(PtbZIP16、PtbZIP17、PtbZIP44、PtbZIP50、PtbZIP51、PtbZIP52、PtbZIP99、PtbZIP100、PtbZIP101、PtbZIP137、PtbZIP138、PtbZIP139、PtbZIP192、PtbZIP193、PtbZIP194、PtbZIP195、PtbZIP196)、H(PtbZIP165、PtbZIP166、PtbZIP167、PtbZIP168、PtbZIP169、 PtbZIP207、PtbZIP208、PtbZIP209)、I(PtbZIP32、PtbZIP33、PtbZIP76、PtbZIP77、PtbZIP105、PtbZIP106、PtbZIP107、PtbZIP143、PtbZIP144、PtbZIP156、PtbZIP180、PtbZIP182、PtbZIP183、PtbZIP184、PtbZIP206、PtbZIP213、PtbZIP214)、S(PtbZIP27、PtbZIP75、PtbZIP98、PtbZIP110、PtbZIP136、PtbZIP155)及其它(圖1)。

表1 楊樹bZIP轉(zhuǎn)錄因子Table 1 Populus bZIP transcription factors

續(xù)表

轉(zhuǎn)錄因子號TF_id編號PtbZIPno.轉(zhuǎn)錄因子號TF_id編號PtbZIPno.轉(zhuǎn)錄因子號TF_id編號PtbZIPno.轉(zhuǎn)錄因子號TF_id編號PtbZIPno.Potri.001G374200.2PtbZIP23Potri.004G163800.2PtbZIP77Potri.006G277800.5PtbZIP131Potri.014G007100.1PtbZIP185Potri.001G374200.3PtbZIP24Potri.004G175200.1PtbZIP78Potri.006G277800.6PtbZIP132Potri.014G013400.1PtbZIP186Potri.001G374200.4PtbZIP25Potri.004G175200.2PtbZIP79Potri.006G277800.7PtbZIP133Potri.014G028200.1PtbZIP187Potri.002G018400.1PtbZIP26Potri.004G175200.3PtbZIP80Potri.006G277800.8PtbZIP134Potri.014G028200.2PtbZIP188Potri.002G031900.1PtbZIP27Potri.004G175200.4PtbZIP81Potri.007G006900.1PtbZIP135Potri.014G028200.3PtbZIP189Potri.002G045800.1PtbZIP28Potri.004G175200.5PtbZIP82Potri.007G019900.1PtbZIP136Potri.014G028200.4PtbZIP190Potri.002G045800.3PtbZIP29Potri.004G175200.6PtbZIP83Potri.007G029400.1PtbZIP137Potri.014G028200.5PtbZIP191Potri.002G045800.4PtbZIP30Potri.004G175200.7PtbZIP84Potri.007G029400.2PtbZIP138Potri.014G062400.1PtbZIP192Potri.002G067400.1PtbZIP31Potri.004G175200.8PtbZIP85Potri.007G029400.3PtbZIP139Potri.014G062400.2PtbZIP193Potri.002G069500.1PtbZIP32Potri.004G203400.1PtbZIP86Potri.007G085700.1PtbZIP140Potri.014G094200.1PtbZIP194Potri.002G069500.2PtbZIP33Potri.004G203400.2PtbZIP87Potri.007G085700.2PtbZIP141Potri.014G094200.2PtbZIP195Potri.002G090700.1PtbZIP34Potri.004G203400.3PtbZIP88Potri.007G085700.3PtbZIP142Potri.014G094200.3PtbZIP196Potri.002G090700.2PtbZIP35Potri.004G203400.4PtbZIP89Potri.007G130800.1PtbZIP143Potri.014G120800.1PtbZIP197Potri.002G090700.4PtbZIP36Potri.004G219100.1PtbZIP90Potri.007G130800.2PtbZIP144Potri.015G047700.1PtbZIP198Potri.002G090700.5PtbZIP37Potri.004G219100.2PtbZIP91Potri.008G010800.1PtbZIP145Potri.016G024000.1PtbZIP199Potri.002G090800.1PtbZIP38Potri.005G053200.1PtbZIP92Potri.008G018400.1PtbZIP146Potri.016G024000.2PtbZIP200Potri.002G115900.1PtbZIP39Potri.005G082000.1PtbZIP93Potri.008G018400.2PtbZIP147Potri.016G032400.1PtbZIP201Potri.002G125400.1PtbZIP40Potri.005G082000.2PtbZIP94Potri.008G106700.1PtbZIP148Potri.016G032400.2PtbZIP202Potri.002G125400.2PtbZIP41Potri.005G082000.3PtbZIP95Potri.008G113400.1PtbZIP149Potri.016G036500.1PtbZIP203Potri.002G125400.3PtbZIP42Potri.005G082000.4PtbZIP96Potri.008G118300.1PtbZIP150Potri.016G049200.1PtbZIP204Potri.002G125400.4PtbZIP43Potri.005G082000.5PtbZIP97Potri.008G118300.2PtbZIP151Potri.016G121700.1PtbZIP205Potri.002G167100.1PtbZIP44Potri.005G119300.1PtbZIP98Potri.009G018500.1PtbZIP152Potri.017G027400.1PtbZIP206Potri.002G196200.1PtbZIP45Potri.005G126000.1PtbZIP99Potri.009G075000.1PtbZIP153Potri.017G106700.1PtbZIP207Potri.002G196200.2PtbZIP46Potri.005G126000.2PtbZIP100Potri.009G101200.1PtbZIP154Potri.018G029500.1PtbZIP208Potri.003G014500.1PtbZIP47Potri.005G126000.3PtbZIP101Potri.009G119700.1PtbZIP155Potri.018G029500.2PtbZIP209Potri.003G014800.2PtbZIP48Potri.005G170500.1PtbZIP102Potri.009G125400.1PtbZIP156Potri.018G029500.3PtbZIP210Potri.003G014800.3PtbZIP49Potri.005G170500.2PtbZIP103Potri.009G134900.1PtbZIP157Potri.019G091900.1PtbZIP211Potri.003G097600.1PtbZIP50Potri.005G170500.4PtbZIP104Potri.009G134900.2PtbZIP158Potri.019G091900.2PtbZIP212Potri.003G097600.2PtbZIP51Potri.005G190700.1PtbZIP105Potri.009G134900.3PtbZIP159Potri.019G130000.1PtbZIP213Potri.003G097600.3PtbZIP52Potri.005G190700.2PtbZIP106Potri.009G134900.4PtbZIP160Potri.019G130000.2PtbZIP214Potri.003G194600.1PtbZIP53Potri.005G190700.3PtbZIP107Potri.009G164300.1PtbZIP161Potri.003G194600.2PtbZIP54Potri.005G192900.1PtbZIP108Potri.009G164300.2PtbZIP162

2.2 楊樹bZIP轉(zhuǎn)錄因子二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是指其多肽鏈有規(guī)則的重復(fù)構(gòu)象，主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲4種構(gòu)象。利用軟件DNAMAN6.0預(yù)測楊樹bZIP家族轉(zhuǎn)錄因子二級結(jié)構(gòu)顯示，bZIP轉(zhuǎn)錄因子序列兩端主要以卷曲為主，而序列中間部分以α-螺旋構(gòu)象為主(圖2)。

2.3 楊樹應(yīng)答鹽脅迫基因鑒定

利用軟件Bioconductor的DESeq(V1.12.1)包分析RNA-seq測序數(shù)據(jù)，獲得65 536條基因在不同樣品中(W1 vs S1, W2 vs S2, W3 vs S3, W4 vs S4)差異表達(dá)結(jié)果，對其按照顯著性標(biāo)準(zhǔn)(基因表達(dá)差異2倍以上且P≤0.05)進(jìn)行篩選，統(tǒng)計(jì)顯著上調(diào)或下調(diào)差異表達(dá)基因(圖3)。結(jié)果表明，W1 vs S1與W4 vs S4兩組下調(diào)表達(dá)基因較多；W2 vs S2與W3 vs S3兩組上調(diào)表達(dá)基因較多。但每組差異表達(dá)基因均占基因總數(shù)的0.9%左右，不同組間差異可能是由試驗(yàn)材料差異造成的生物學(xué)重復(fù)誤差。

圖1 楊樹bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族保守域序列比對及無根系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建Fig.1 Multiple alignment and unrooted phylogenetic tree construction of poplar bZIP transcription factors

2.4 楊樹應(yīng)答鹽脅迫bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)模式分析

利用生物信息學(xué)分析方法結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，從214條楊樹bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因中篩選出應(yīng)答鹽脅迫基因19條(圖4)。其中鹽脅迫處理后，上調(diào)表達(dá)基因14條，下調(diào)表達(dá)基因5條。大部分差異表達(dá)基因位于1號及2號染色體上。PtbZIP36和PtbZIP195鹽脅迫處理后基因表達(dá)量分別達(dá)到了200和100左右，其他基因表達(dá)水平相對較低。

2.5 楊樹應(yīng)答鹽脅迫bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因聚類分析

根據(jù)基因表達(dá)量(FPKM)，對楊樹應(yīng)答鹽脅迫bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，19個(gè)應(yīng)答鹽脅迫差異表達(dá)的基因大致可為分為表達(dá)量高、中、低3類(圖5)。其中高表達(dá)量的基因只有PtbZIP36一個(gè)；中表達(dá)量的基因有PtbZIP40及PtbZIP195兩個(gè)；其余16個(gè)基因在鹽脅迫處理前后的表達(dá)量均相對較低。

圖2 楊樹bZIP轉(zhuǎn)錄因子二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 Secondary structure prediction of Populus bZIP transcription factors

圖3 鹽脅迫條件下差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)Fig.3 Differential expression of genes in response to salt stress

3 討論與結(jié)論

植物體內(nèi)bZIP轉(zhuǎn)錄因子一般由60～80氨基酸殘基組成，包含2個(gè)位于連續(xù)α-螺旋序列中的高度保守的結(jié)構(gòu)域：一個(gè)是含有約16個(gè)氨基酸的堿性結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠通過N-x7-R/K元件與DNA結(jié)合，起到核定位信號的作用；另一個(gè)是由位于氨基酸序列C端第9位的亮氨酸或者其它疏水性氨基酸殘基形成的亮氨酸拉鏈區(qū)(亮氨酸每隔7個(gè)氨基酸殘基重復(fù)出現(xiàn)一次)，該區(qū)域組成的水脂雙親性螺旋結(jié)構(gòu)通過參與蛋白質(zhì)二聚體化進(jìn)而參與bZIP轉(zhuǎn)錄因子與DNA的互作[5]。

本研究參考擬南芥bZIP轉(zhuǎn)錄因子分類方法，將楊樹bZIP轉(zhuǎn)錄因子分為11個(gè)亞族(圖1)。研究表明，除I亞族外，A、B、C、D、E、F、G、H及S亞族均含有相對保守一致的bZIP結(jié)構(gòu)域[5]。A 亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子大多與植物體內(nèi)ABA信號及脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，如擬南芥bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因AtbZIP39/ABI5，bZIP36/ABF2/AREB1，AtbZIP38/ABF4/AREB2，AtbZIP66/AREB3，AtbZIP40/GBF4，AtbZIP35/ABF1 及AtbZIP37/ABF3等[12, 13]。C亞族轉(zhuǎn)錄因子具有顯著的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在幾乎所有植物內(nèi)均含有一個(gè)延伸至9次重復(fù)的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，其潛在的調(diào)控核轉(zhuǎn)運(yùn)與DAN結(jié)合特性的磷酸化修飾位點(diǎn)序列亦高度保守。C亞族轉(zhuǎn)錄因子主要參與種子發(fā)育及生物脅迫與非生物脅迫應(yīng)答過程[8, 14]。D亞族轉(zhuǎn)錄因子通過與TGA因子互作在植物抵御逆境脅迫過程中發(fā)揮重要作用，還有少數(shù)D亞族轉(zhuǎn)錄因子能夠參與調(diào)控植物的發(fā)育過程[10 ]。關(guān)于E亞族轉(zhuǎn)錄因子功能的研究報(bào)道較少，其與I亞族在亮氨酸拉鏈區(qū)具有高度的相似性，但是由于第10位賴氨酸的缺失，將其定義為不同的亞族[5]。G亞族轉(zhuǎn)錄因子主要參與紫外線及藍(lán)光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等光信號應(yīng)答過程，在種子成熟過程中也起到調(diào)控作用[15]。H亞族轉(zhuǎn)錄因子主要參與植物的光合作用過程。I亞族轉(zhuǎn)錄因子主要與導(dǎo)管發(fā)育相關(guān)，調(diào)控赤霉素生物合成和韌皮部形成過程。S亞族轉(zhuǎn)錄因子不僅參與植物糖類代謝過程，在逆境脅迫應(yīng)答及花器官發(fā)育過程中也發(fā)揮重要作用[5]。

圖4 楊樹bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因應(yīng)答鹽脅迫表達(dá)模式分析Fig.4 Expression pattern analysis of Poplulus bZIP transcription factor genes in response to salt stress

圖5 楊樹應(yīng)答鹽脅迫bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因聚類分析Fig.5 Gene clustering analysis of Poplulus bZIP transcription factor genes in response to salt stress

通過RNA-seq數(shù)據(jù)分析篩選出楊樹應(yīng)答鹽脅迫bZIP轉(zhuǎn)錄因子19個(gè)，約占bZIP家族成員的10%。進(jìn)一步分析表明，19個(gè)bZIP差異表達(dá)基因中有6(約1/3)個(gè)屬于D亞族，其他bZIP差異表達(dá)基因主要屬于C亞族與G亞族，結(jié)果與植物C、D、G亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育及抵御逆境脅迫中發(fā)揮重要作用的結(jié)論基本一致[5]，說明bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族在楊樹鹽脅迫逆境應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要的作用，為楊樹bZIP轉(zhuǎn)錄因子功能的進(jìn)一步研究奠定理論基礎(chǔ)。