低頻重復經(jīng)顱磁刺激對氯化鋰-匹魯卡品慢性癲癇大鼠海馬CA3區(qū)PGP、MRP1、MVP表達的影響

趙安容 王 莉 余巨明 王圣之

(川北醫(yī)學院神經(jīng)疾病研究所，四川 南充 637000)

癲癇具有明顯的反復發(fā)作傾向，嚴重影響患者的神經(jīng)生物學、認知及心理功能，治療仍以藥物為主。近年來，盡管抗癲癇藥物的研發(fā)及臨床應用取得了相當大的進展，但仍有20%～30%的患者不能控制癲癇發(fā)作而成為難治性癲癇(IE)〔1，2〕。最新的研究提示，多藥耐藥蛋白(MDRP)過度表達可能參與了IE形成的機制，其中最受關(guān)注的MDRP包括P-糖蛋白(PGP)、多藥耐藥相關(guān)蛋白家族(MRPs)和主穹窿蛋白(MVP)/肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)。低頻重復經(jīng)顱磁刺激(rTMS)對癲癇發(fā)作有明確的抑制作用，可降低癲癇患者的發(fā)作頻率，改善腦電圖〔3〕；動物實驗亦表明，低頻rTMS可以延長癲癇模型發(fā)作潛伏期〔4，5〕。本文擬觀察低頻rTMS對氯化鋰-匹魯卡品慢性癲癇大鼠海馬內(nèi)MDRP表達的影響，探討低頻rTMS的抗癇機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選取健康雄性SD大鼠60只，8周齡，體重210～230 g，平均(219.9±7.2)g，由川北醫(yī)學院實驗動物中心提供。按照隨機數(shù)字表法分為對照組，模型組，假刺激組，治療組，每組15只。

1.2主要儀器及試劑 儀器：MagPro R30型磁刺激器及MCF75環(huán)形線圈(Medtronic公司，丹麥)。

藥品及試劑：匹魯卡品(Sigma公司，美國)；東莨菪堿(Sigma公司，美國)；氯化鋰(Amresco公司，美國)；PGP、MVP及MRP1兔抗大鼠多克隆抗體(北京博奧生物科技有限公司)；SABC、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3模型制備 慢性癲癇大鼠模型制備參照Glien等〔6〕及張小東等〔7〕的方法：1.5 mol/L氯化鋰腹腔注射，劑量127.17 mg/kg；18 h后注射0.25 mg/ml東莨菪堿，劑量1 mg/kg；之后每隔30 min注射7.5 mg/ml的匹魯卡品，劑量10 mg/kg，重復3～5次。大鼠急性期出現(xiàn)Ⅳ級以上的癲癇發(fā)作且經(jīng)過1 w恢復后持續(xù)監(jiān)測大鼠行為學表現(xiàn)。出現(xiàn)靜息期癲癇發(fā)作的大鼠進行腦電圖監(jiān)測，若出現(xiàn)癇樣放電則為慢性癲癇大鼠模型構(gòu)建成功。對照組于相同時刻注射等量生理鹽水。

1.4低頻磁刺激(rTMS)治療 將大鼠的頭部固定于MagPro R30型磁刺激器(頻率：0.5 Hz，40%MT)進行接收治療，其余部位固定于非磁場區(qū)。每串100次，每日5串，間隔30 s，治療持續(xù)14 d。假刺激組給予頻率、次數(shù)及聲音相似的刺激，無能量輸出。

1.5觀察指標

1.5.1大鼠癲癇發(fā)作情況 以模型構(gòu)建成功為0 d，觀察持續(xù)14 d，比較各組大鼠觀察期間的癲癇發(fā)作次數(shù)及發(fā)作級別(取最高值)。發(fā)作級別評價參照Racine〔8〕的評價標準。

1.5.2大鼠CA3區(qū)PGP、MRP1及MVP水平檢測 于觀察結(jié)束后處死大鼠，檢測CA3區(qū)PGP、MRP1及MVP水平，采用免疫組化法，操作嚴格按照說明書進行。采用Image Pro Plus6.0圖像軟件對目標蛋白的表達水平進行半定量分析，記錄大鼠的平均光密度(IOD)。于治療1、7、14 d分別處死5只小鼠檢查目標蛋白表達量。

1.6統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件，計量資料比較采用t檢驗或單因素方差分析，等級資料采用秩和檢驗、計數(shù)資料行χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組癲癇大鼠發(fā)作情況比較 模型組及假刺激組癲癇發(fā)作頻率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，治療組癲癇發(fā)作頻率低于模型組及假刺激組(P<0.05)。各組大鼠癲癇發(fā)作頻率及級別的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠發(fā)作情況比較(n,n=15)

與模型組相比：1)P<0.05；與假刺激組相比：2)P<0.05

2.2各組CA3區(qū)PGP、MRP1及MVP表達水平比較 與對照組相比，模型組及假刺激組的PGP、MRP1及MVP表達水平顯著升高(P<0.05)，但模型組與假刺激組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療組PGP、MRP1及MVP表達水平顯著低于模型組及假刺激組，較對照組顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2，圖1～圖3。

表2 各組CA3區(qū)PGP、MRP1及MVP表達水平比較

與模型組相比：1)P<0.05；與假刺激組相比：2)P<0.05；與對照組相比：3)P<0.05

圖2 各組MRP1免疫組化染色結(jié)果(×400)

圖3 各組MVP免疫組化染色結(jié)果(×400)

2.3治療組不同時點PGP、MRP1及MVP表達水平 與治療1 d相比，治療7 d的PGP無明顯變化(P>0.05)，治療7 d的MRP1及MVP表達水平顯著降低(P<0.05)，治療14 d的PGP、MRP1及MVP表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖4。

圖4 治療組不同時刻PGP、MRP1、MVP表達水平

3 討 論

目前，癲癇臨床治療仍以藥物為主，盡管藥物研究已經(jīng)取得明顯的進展，但仍有部分患者的療效不佳，與患者的耐藥性有關(guān)。癲癇患者耐藥性與MDRP的表達具有密切的相關(guān)性，其中PGP、MRP1及MVP均與抗癲癇藥(AEDs)的耐藥現(xiàn)象相關(guān)。PGP及MRP1作為重要的藥物轉(zhuǎn)運蛋白，能夠?qū)EDs泵出細胞，MVP通過胞吐及細胞核膜封鎖復合體的產(chǎn)生阻止AEDs進入細胞〔9〕。

既往研究發(fā)現(xiàn)，癲癇患者存在MDRP高表達現(xiàn)象。Liu等〔10〕及Sisodiya等〔11，12〕研究發(fā)現(xiàn)手術(shù)切除的患者病灶中PGP、MRP1及MVP表達水平顯著升高。Chen等〔13〕對杏仁核點燃構(gòu)建的癲癇大鼠的大腦皮層及海馬組織中的MRP表達水平進行檢測，PCR及Western印跡顯示MRP mRNA及蛋白表達水平均明顯升高。本研究結(jié)果說明慢性癲癇大鼠腦組織中存在耐藥蛋白高表達，導致耐藥性的產(chǎn)生。

目前，對耐藥蛋白表達的干預在癲癇治療中的應用價值逐漸引起臨床重視。Zhang等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)維拉帕米能夠通過阻斷PGP相關(guān)的轉(zhuǎn)運通道增強抗癲癇藥物的作用。Mairinger等〔15〕發(fā)現(xiàn)PGP及MRP1能夠阻止N-去甲基衍生物進入血腦屏障，降低抗癲癇藥物的親和力，故其在臨床上的應用存在一定的爭議。

李倩等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過rTMS治療，大鼠丘腦內(nèi)PGP的表達水平顯著升高，與本次研究結(jié)果一致。本次研究發(fā)現(xiàn)，rTMS具有明顯的后效應，這點對其用于癲癇的治療非常重要。本研究說明低頻rTMS能夠通過降低MDRP的表達水平減輕癲癇癥狀，但低頻rTMS影響MDRP表達水平的具體機制仍有待進一步研究。