MS-222和丁香酚對克氏原螯蝦幼蝦耗氧率、排氨率及窒息點(diǎn)的影響

徐濱，魏開金，朱祥云，徐進(jìn)，馬寶珊

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 武漢 430223)

水生動物生產(chǎn)過程中使用的麻醉劑種類較多，包括MS-222、丁香酚、苯唑卡因和利多卡因等，其中，MS-222和丁香酚是常用麻醉劑[1-4]，在國內(nèi)外研究和生產(chǎn)中使用較多。在水產(chǎn)品運(yùn)輸中使用麻醉劑可以降低魚類的耗氧量和氨氮排放量，有效防止其在運(yùn)輸時(shí)激烈活動造成的傷害，從而增加運(yùn)輸距離和運(yùn)輸量，提高存活率。耗氧率和排氨率是動物能量代謝強(qiáng)度的重要指標(biāo), 既可以反映動物的生理水平，也可以反映環(huán)境變化帶來的影響[5-6]。研究表明，麻醉會引起魚類耗氧率和排氨率發(fā)生變化[7-9]，關(guān)于麻醉劑對蝦類的麻醉行為和麻醉效果曾有研究報(bào)道[10-11]，但有關(guān)麻醉后蝦類耗氧率和排氨率的變化尚未見報(bào)道。

克氏原螯蝦Procambarusclarkii又稱小龍蝦、淡水龍蝦，隸屬于甲殼綱Crustacea、十足目Decapoda、螯蝦科Cabaridae、原螯蝦屬Procambarus，原產(chǎn)于墨西哥北部和美國南部，后發(fā)展至夏威夷、日本、歐洲和尼羅河流域，大約在20世紀(jì)30年代末期由日本引入中國南京市，由于該蝦適應(yīng)性強(qiáng)，對水質(zhì)要求不高，適宜淡水養(yǎng)殖，目前已在中國各大水系均有分布?？耸显r味道鮮美、營養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛，是中國重要的水產(chǎn)資源種類[12-13]，也是目前淡水蝦類增養(yǎng)殖的主要品種。近年來，隨著其養(yǎng)殖地位的提高，有關(guān)人員對克氏原螯蝦的關(guān)注日益增多。作者在調(diào)研期間，發(fā)現(xiàn)許多養(yǎng)殖戶長途運(yùn)輸蝦苗和種蝦時(shí)，常因運(yùn)輸方法不當(dāng)，在放養(yǎng)一周內(nèi)造成蝦苗大量死亡。為此，本研究中首次探討了兩種麻醉劑對克氏原螯蝦幼蝦耗氧率、排氨率和窒息點(diǎn)的影響，旨在為克氏原螯蝦選擇合適的麻醉劑，減少生產(chǎn)和選育過程中各種不當(dāng)操作對其帶來的傷害，提高其存活率，同時(shí)為克氏原螯蝦的呼吸生理學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)蝦采自湖北潛江后湖某養(yǎng)殖場，選取體質(zhì)量為(4.18±0.54)g的健康克氏原螯蝦，在長江

水產(chǎn)研究所循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)暫養(yǎng)兩周。飼養(yǎng)水為經(jīng)過濾后充分曝氣的自來水，水中溶氧為(7.0±0.3)mg/L，水溫為(18±1)℃，pH 為(7.6±0.2)。試驗(yàn)前1 d停止喂食。

試驗(yàn)用麻醉劑MS-222和丁香酚均購自武漢普洛斯試劑有限公司。MS-222水溶液略呈酸性，與碳酸氫鈉按質(zhì)量比為1∶1混合溶于水后使用，可降低麻醉過程中的應(yīng)激反應(yīng)。丁香酚為蒼黃色液體，不溶于水，可溶于酒精，使用時(shí)按質(zhì)量比為1∶5的比例溶于酒精后再溶于水[8]。將麻醉劑分別配制成母液，隨用隨配。

試驗(yàn)裝置為自制的密封靜止水式呼吸測定儀，根據(jù)蝦體的大小選用2.5 L的錐形試驗(yàn)瓶。采用保鮮膜密封口，不能產(chǎn)生氣泡，以恒溫水槽控溫，溫度誤差控制在±0.5 ℃。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度麻醉劑對克氏原螯蝦幼蝦耗氧率和排氨率的影響試驗(yàn) MS-222質(zhì)量濃度分別設(shè)置為0、20、40、60、80、100 mg/L，丁香酚質(zhì)量濃度分別設(shè)置為0、8、16、24、32、40 mg/L。每個(gè)錐形瓶中投放10尾克氏原螯蝦幼蝦，每個(gè)濃度試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行組，另設(shè)1個(gè)空白對照組(呼吸室無蝦)，水溫為(18.0±0.5)℃。

在暫養(yǎng)池內(nèi)隨機(jī)撈取試驗(yàn)蝦，放入清水中禁食1 d后進(jìn)行正式試驗(yàn)。試驗(yàn)在15:00—17:00進(jìn)行，試驗(yàn)開始時(shí)將蝦快速放入試驗(yàn)瓶中，用虹吸法利用導(dǎo)管向試驗(yàn)瓶內(nèi)加水，直至瓶內(nèi)水量增加1倍，封口后將試驗(yàn)瓶放置在恒溫水槽中，并置于光線暗處。試驗(yàn)結(jié)束后，為使瓶里面的溶解氧和氨氮混合均勻，將試驗(yàn)瓶搖晃顛倒3～4次，用導(dǎo)管插入瓶底再利用虹吸原理快速采集水樣。分別采用Winkler氏碘量法和奈氏試劑法即時(shí)測定試驗(yàn)組和對照組試驗(yàn)瓶內(nèi)的溶解氧和氨氮濃度，用濾紙吸干蝦體水分，在電子天平上稱量其濕質(zhì)量(精確到0.01 g)。

1.2.2 窒息點(diǎn)的測定 采用靜水呼吸室法，呼吸室為2.5 L的錐形瓶，用保鮮膜密封瓶口, 利用虹吸原理進(jìn)水和采集水樣。在呼吸室中放幼蝦10尾，并設(shè)3個(gè)平行，將試驗(yàn)瓶置于恒溫水槽中進(jìn)行試驗(yàn)。測定試驗(yàn)蝦死亡半數(shù)時(shí)的溶解氧濃度，作為該溫度下的窒息點(diǎn)。

1.2.3 指標(biāo)的測定與計(jì)算 耗氧量[mg/(ind.·h)]、耗氧率[mg/(g·h)]、排氨量[μg/(ind.·h)]、排氨率[μg/(g·h)]計(jì)算公式分別為

耗氧量=(B1-B2)×V/(M×t)，

耗氧率=(B1-B2)×V/(W×t)，

排氨量=(B1′-B2′)×V/(M×t)，

排氨率=(B1′-B2′)×V/(W×t)。

其中：B1、B2分別為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對照瓶和試驗(yàn)瓶中溶解氧濃度(mg/L)；B1′、B2′分別為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對照瓶和試驗(yàn)瓶中氨氮濃度(mg/L)；V為試驗(yàn)瓶體積(L)；M為受試蝦數(shù)量(ind.)；W為受試蝦的總體質(zhì)量(g)；t為試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間(h)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，用Excel與SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 MS-222對克氏原螯蝦幼蝦耗氧率、排氨率的影響

MS-222對克氏原螯蝦耗氧率和耗氧量的影響如圖1所示，隨著MS-222濃度的升高，克氏原螯蝦耗氧率和耗氧量均呈先升高后下降的趨勢。與耗氧量相比，耗氧率更能反映其代謝水平變化。單因素方差分析表明：當(dāng)MS-222濃度為20 mg/L時(shí)，克氏原螯蝦耗氧率高于0 mg/L濃度組(對照組)，但無顯著性差異(P>0.05)；當(dāng)MS-222濃度為40 mg/L時(shí)，克氏原螯蝦耗氧率顯著高于對照組和其他濃度組(P<0.05)；隨著MS-222濃度的繼續(xù)升高，克氏原螯蝦耗氧率開始下降，MS-222濃度為60～100 mg/L時(shí)與對照組無顯著性差異(P>0.05)。

注：同一指標(biāo)中，標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05),下同Note:The means with different letters in same index are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters are not significant differences, et sequentia圖1 MS-222對克氏原螯蝦耗氧率和耗氧量的影響Fig.1 Effect of MS-222 on oxygen consumption rate and oxygen consumption in red swamp crawfish Procambarus clarkii

MS-222對克氏原螯蝦排氨率和排氨量的影響如圖2所示，隨著MS-222濃度的升高，克氏原螯蝦排氨率和排氨量均呈先升高后下降的趨勢。單因素方差分析表明：當(dāng)MS-222濃度為20 mg/L時(shí)，克氏原螯蝦排氨率略高于對照組，但無顯著性差異(P>0.05)；當(dāng)MS-222濃度為40 mg/L時(shí)，克氏原螯蝦排氨率顯著高于對照組和其他濃度組(P<0.05)；隨著MS-222濃度的繼續(xù)升高，克氏原螯蝦排氨率開始下降，MS-222濃度為60～100 mg/L時(shí)與對照組均無顯著性差異(P>0.05)，但100 mg/L濃度組排氨率顯著低于20～60 mg/L濃度組(P<0.05)。

圖2 MS-222對克氏原螯蝦排氨率和排氨量的影響Fig.2 Effect of MS-222 on ammonia excretion rate and ammonia excretion in red swamp crawfish Procambarus clarkii

2.2 丁香酚對克氏原螯蝦幼蝦耗氧率、排氨率的影響

丁香酚對克氏原螯蝦耗氧率和耗氧量的影響如圖3所示，隨著丁香酚濃度的升高，克氏原螯蝦耗氧率和耗氧量呈先升高后下降的趨勢。單因素方差分析表明：當(dāng)丁香酚濃度為8 mg/L時(shí)，克氏原螯蝦耗氧率略高于對照組，但無顯著性差異(P>0.05)；當(dāng)丁香酚濃度為16～24 mg/L時(shí)，克氏原螯蝦耗氧率顯著高于對照組(P<0.05)；隨著丁香酚濃度的繼續(xù)升高，克氏原螯蝦耗氧率開始下降，丁香酚濃度為32 mg/L時(shí)，耗氧率與對照組無顯著性差異(P>0.05)，而濃度為40 mg/L時(shí)，耗氧率顯著低于對照組和其他濃度組(P<0.05)。

丁香酚對克氏原螯蝦排氨率和排氨量的影響如圖4所示，隨著丁香酚濃度的升高，丁香酚對克氏原螯蝦排氨率和排氨量呈先升高后下降的趨勢。單因素方差分析表明：當(dāng)丁香酚濃度為8 mg/L時(shí)，克氏原螯蝦排氨率高于對照組，但無顯著性差異(P>0.05)；當(dāng)丁香酚濃度為16～24 mg/L時(shí)，克氏原螯蝦排氨率顯著高于對照組(P<0.05)；隨著丁香酚濃度的繼續(xù)升高，克氏原螯蝦排氨率開始下降，丁香酚濃度為32 mg/L時(shí)，排氨率與對照組無顯著性差異(P>0.05)，而濃度為40 mg/L時(shí)，排氨率顯著低于對照組(P<0.05)。

圖3 丁香酚對克氏原螯蝦耗氧率和耗氧量的影響Fig.3 Effect of clove oil on oxygen consumption rate and oxygen consumption in red swamp crawfish Procambarus clarkii

圖4 丁香酚對克氏原螯蝦排氨率和排氨量的影響Fig.4 Effect of clove oil on ammonia excretion rate and ammonia excretion in red swamp crawfish Procambarus clarkii

2.3 麻醉后克氏原螯蝦幼蝦窒息點(diǎn)的變化

試驗(yàn)3 h時(shí)對照組蝦開始死亡，4 h時(shí)MS-222組開始出現(xiàn)死蝦，最后是丁香酚組。麻醉對克氏原螯蝦窒息點(diǎn)的影響見表1，其窒息點(diǎn)依次為丁香酚組>MS-222組>對照組，且各組間有顯著性差異(P<0.05)。

表1 麻醉對克氏原螯蝦窒息點(diǎn)的影響

注：同列中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)

Note:The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences

3 討論

3.1 兩種麻醉劑對克氏原螯蝦幼蝦耗氧和氨氮排放的影響

水生動物的代謝活動多與氧的利用密切相關(guān)，耗氧率可以直接或間接地反映其新陳代謝和生理狀況。對水生動物耗氧率的測定不僅可以為動物生理學(xué)提供基礎(chǔ)資料，在養(yǎng)殖過程中也有一定的應(yīng)用價(jià)值[14]，研究發(fā)現(xiàn)：大多數(shù)小型水生生物比大型水生生物的耗氧率會高一些[15]。研究表明：魚麻醉后的行為首先表現(xiàn)為短暫興奮，游泳更迅速；然后魚體開始失去平衡，游泳速度減慢，同時(shí)鰓動頻率變慢；最后停止運(yùn)動，鰓動微弱[16-17]。而蝦類麻醉后的行為與魚類差異較大，本研究中，在將克氏原螯蝦放入試驗(yàn)瓶后,短時(shí)間內(nèi)克氏原螯蝦靜臥底部，游泳足正常擺動；然后開始有蝦快速地向上游向瓶口，想要逃出；再經(jīng)過一段時(shí)間后蝦又回到底部靜臥。

本研究中同時(shí)測量了克氏原螯蝦的耗氧量與耗氧率、排氨量與排氨率，試驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然同一個(gè)體的耗氧量與耗氧率、排氨量與排氨率的變化規(guī)律是一致的，但在試驗(yàn)中，由于試驗(yàn)個(gè)體的體質(zhì)量差異和計(jì)算方式不同，進(jìn)行群體統(tǒng)計(jì)時(shí)耗氧率和排氨率更能明顯地反映其生理變化。本試驗(yàn)中，濃度為20～100 mg/L 的MS-222不能降低克氏原螯蝦的耗氧率，雖然濃度為100 mg/L 的MS-222可以降低其排氨率，但與對照組相比無顯著性差異，這表明，MS-222對克氏原螯蝦基本無麻醉作用，這與MS-222對羅氏沼蝦[10]和日本對蝦[11]無麻醉作用的結(jié)論一致。

經(jīng)不同濃度的丁香酚麻醉后，克氏原螯蝦的耗氧率和排氨率均呈先升高后降低趨勢。低濃度麻醉時(shí)，克氏原螯蝦的耗氧率和排氨率均升高，其原因是低濃度的麻醉劑對克氏原螯蝦產(chǎn)生一定的脅迫作用，造成蝦的活動增多，同時(shí)新陳代謝的強(qiáng)度增大。而高濃度麻醉時(shí)，克氏原螯蝦的耗氧率和排氨率降低，原因是丁香酚使克氏原螯蝦進(jìn)入麻醉過程的各個(gè)時(shí)期，蝦的耗氧率和排氨率均呈不同程度的下降，其中40 mg/L濃度組蝦的耗氧率及排氨率均顯著低于對照組。對羅氏沼蝦及日本對蝦的麻醉行為和復(fù)蘇時(shí)間進(jìn)行的研究也表明，丁香酚也可以使羅氏沼蝦及日本對蝦進(jìn)入麻醉狀態(tài)，對其有麻醉效果[10-11]。

研究表明，蝦類在麻醉劑選擇范圍上比魚類要狹隘。在運(yùn)輸上，合適劑量的麻醉劑尤其是關(guān)鍵，若麻醉劑濃度較低，蝦不能進(jìn)入麻醉狀態(tài)，達(dá)不到應(yīng)有的效果；若麻醉劑濃度過高，則可能對克氏原螯蝦造成潛在的傷害，并造成損失。本研究表明，丁香酚質(zhì)量濃度為40 mg/L時(shí)，可顯著降低克氏原螯蝦的耗氧率和排氨率，同時(shí)還能控制其過度活動造成的傷害，利于提高運(yùn)輸后其存活率，滿足運(yùn)輸?shù)囊蟆?/p>

3.2 麻醉對克氏原螯蝦窒息點(diǎn)的影響

丁香酚組與MS-222組克氏原螯蝦的窒息點(diǎn)均顯著高于對照組。對魚類麻醉的研究表明，雖然麻醉可以降低魚類的代謝水平，但麻醉劑量過大或麻醉時(shí)間過長時(shí)會深及髓質(zhì)，造成呼吸與血管舒縮中樞麻痹，最終導(dǎo)致死亡[18]。用麻醉劑麻醉對蝦類的影響應(yīng)與魚類類似。本研究表明，丁香酚組對克氏原螯蝦的麻醉程度要高于MS-222組。因此，在生產(chǎn)、試驗(yàn)操作和運(yùn)輸過程中不能使用過高劑量的麻醉劑，且麻醉時(shí)間也不能過長，建議麻醉時(shí)間不超過4 h。