酶解法與HPLC法相結(jié)合檢測金錢草膠囊在人體內(nèi)藥代動力學

暨南大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院/深圳市人民醫(yī)院，廣東 深圳 518040

金錢草也被成為神仙對坐草、地蜈蚣，其味酸、苦，可供藥用，有清熱利尿、消炎解毒、殺蟲之功[1]。金錢草膠囊是當前臨床上使用新鮮或干燥金錢草作為原料的中藥制劑，其主要有效成分為槲皮素[2]?，F(xiàn)代藥理研究證實，金錢草膠囊在肝膽和泌尿系統(tǒng)結(jié)石、濕熱黃疸、腎炎水腫以及跌打損傷治療中均具有較好效果[3]。因為該藥物為中藥制劑，不良反應(yīng)較少，因此在臨床上應(yīng)用越來越廣泛。當前臨床上主要采用高效液相色譜-紫外檢測方法對藥物中槲皮素及其在人體中藥代動力學情況進行測定[4]。為進一步探究金錢草膠囊在人體內(nèi)藥代動力學，本研究先使用酶解法獲得其有效成分游離槲皮素苷元，之后再使用高效液相色譜法對血藥濃度進行檢測。

1 資料與方法

1.1 受試者選擇 15名健康男性志愿者，體質(zhì)量63～73 kg，平均體重(62.1±6.9)kg；年齡20～29歲，平均年齡(25.2±1. 4)歲；身高160～172 cm，平均身高(167.5±4.1)cm；志愿者的年齡、體重等基本資料均在標準范圍內(nèi)。納入標準：不吸煙，不嗜酒，身體健康；無心、肝、腎、肺、消化道系統(tǒng)等疾病史；精神狀態(tài)正常；體檢及實驗室檢查結(jié)果均正常；無金錢草膠囊等藥物過敏史；試驗前2周及試驗期間未使用任何藥物。所有志愿者均簽署知情同意書，自愿參加此次研究，且該研究獲我院倫理委員會批準。

1.2 試驗方案 志愿者于試驗前1日和試驗期內(nèi)禁止吸煙和飲用酒類、咖啡類或果汁飲料；試驗前1 日晚17：00統(tǒng)一標準晚餐，禁食12 h。次日早晨空腹單次口服金錢草膠囊1.6 g，用200 mL溫開水吞服；服藥2 h 后方可再飲水、統(tǒng)一進食標準餐。分別于給藥前及給藥后0、1、2、3、4、5、6、7、8 h 肘靜脈取血4 mL，置于干燥管中，靜止30 min，10000 r/min離心10 min，取上清液置-75℃冰箱中做好標記保存。

1.3 槲皮素對照品溶液配制 精密稱取槲皮素對照品10 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制得質(zhì)量濃度為400 μg/mL的槲皮素對照品貯備液，置4 ℃冰箱中備用。

1.4 血漿樣品的提取與分離 將血漿樣品于室溫解凍后，精密量取志愿者血漿樣品0.5 mL置于離心管中，0.58 mol·L-1冰醋酸20 μL 和10 kU·mL-1β-葡萄糖醛酸苷酶液20 μL，將PH調(diào)至4.5～5.0，旋渦30 s混勻后，37 ℃水浴30 min，水解完畢后，加入對照品槲皮素溶液10 μL，旋渦振蕩5 min，10 000 r/min離心10 min，吸取上清液，50 ℃水浴氮氣流吹干，0.8 mL甲醇溶解殘渣，旋渦振蕩30 s，10 000 r/min離心3 min，進樣量20 μL進行測定。

1.5 統(tǒng)計分析 采用DAS ver 2.1.1軟件對志愿者不同時間的血藥濃度數(shù)據(jù)進行分析并計算各藥代動力學參數(shù)，梯形法計算AUC。

2 結(jié)果

2.1 酶解條件 血漿樣品處理過程分別加入320、160、80、40、20、10、5、4、3、2、1 kU·mL-1不同濃度配制的β-葡萄糖醛酸苷酶液20 μL，結(jié)果顯示當酶濃度為10 kU·mL-1時水解效率最高。另考察了酶解時間30 min 達到峰值。

2.2 精密度與準確度 制備含槲皮素對照品溶液配制質(zhì)量濃度分別為0.16、2.40、8.00 μg/mL的3種含藥血漿質(zhì)控樣品，每批每個濃度各5份，按“血漿樣品的提取與分離”項下方法操作，連續(xù)做6 d，并且在1 d內(nèi)重復測定6次，記錄槲皮素峰面積，實測濃度計算日內(nèi)、日間精密度及回收率，見表1。

表1 精密度、準確度與回收率結(jié)果

2.3 人體內(nèi)藥代動力學研究 15名健康男性志愿者口服1.6 g金錢草膠囊后，金錢草膠囊的平均血藥濃度-時間曲線見圖1，主要藥代動力學參數(shù)見表2。

表2 口服1.6 g金錢草膠囊人體內(nèi)藥代動力學參數(shù)

3 討論

金錢草膠囊以中藥金錢草作為原材料，其主要有效成分為槲皮素。槲皮素為多羥基黃酮類化合物，其主要存在形式為苷元[5-7]。為了探討金錢草膠囊的藥代動力學情況，筆者使用酶解法與高效液相色譜相結(jié)合的方法對藥物中主要有效成分進行血藥濃度測定。

槲皮素在經(jīng)人體胃腸道吸收并且進入血液后往往與血液中其他成分相結(jié)合，因此若要對游離槲皮素進行檢測必須對其進行水解處理[8-9]。以往實驗在對槲皮素進行水解時往往采用酸水解，但是該方法卻需要加熱回流因此對于樣本量較少的研究不太適用。本研究中采用酶解法對金錢草膠囊中槲皮素進行分離萃取，通過對水解條件、試劑以及提取方式等進行優(yōu)化取得了較好的效果。使用β-葡萄糖醛酸苷酶液對槲皮素進行分離能夠有效提取苷元。本研究在血漿樣本中加入不同濃度的β-葡萄糖醛酸苷酶液后發(fā)現(xiàn)當酶濃度在10 kU·mL-1時水解效率最高。對于分離金錢草膠囊中有效成分的水解條件給了很好的啟示。血漿樣本的色譜峰具備較好的分離度，同時，檢測的精密度和準確性均能夠符合藥代動力學檢測的要求。同時本研究還對酶解的條件問題進行了考察，結(jié)果顯示，當酶濃度為10 kU·mL-1時水解效率最高，并且在酶解時間30 min時達到峰值。

另外本研究顯示，15名受試者在口服金錢草膠囊后其體內(nèi)槲皮素苷元的Tmax存在較大波動，同時還有5名患者存在雙峰現(xiàn)象，這樣進一步提示肝腸循環(huán)可能也參與了金錢草膠囊在人體內(nèi)胃腸道吸收的過程。另外，受個體差異的影響，β-葡萄糖醛酸苷酶在不同人體內(nèi)活性也存在較大差異，這也是造成Cmax與AUC存在較大差異的原因。

綜上，本研究結(jié)果顯示，酶解法聯(lián)合高效液相色譜法能夠有效對金錢草膠囊制劑的生物學特性以及藥代動力學情況進行有效分析，為今后藥學研究以及臨床更加合理使用藥物提供了參考。