高效液相色譜法檢測牛肉中3類12種獸藥殘留的研究

（廣西獸藥監(jiān)察所，廣西南寧 530001）

獸藥對于動物疾病的預(yù)防、診斷、治療來說都是非常重要的。但是如果不合理的使用獸藥，無疑會導(dǎo)致動物體內(nèi)藥物的滯留和蓄積，并以殘留方式進(jìn)入人體或生態(tài)系統(tǒng)[1]。獸藥殘留的毒性作用大多是通過長期積累而造成的，比如磺胺類藥物殘留的副反應(yīng)有過敏反應(yīng)、泌尿系統(tǒng)損害、血液系統(tǒng)的反應(yīng)；四環(huán)素類藥物殘留容易與骨骼中的鈣結(jié)合，從而抑制骨骼和牙齒的生長；氯霉素能引起人的再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病。氯霉素是禁用藥物[2]，磺胺類、四環(huán)素類獸藥是獸醫(yī)臨床上常用[3]且容易被濫用的藥物。因此建立獸藥多殘留快速檢測方法非常有必要。

國內(nèi)外現(xiàn)有的多殘留檢測方法主要有LC-Q-TOF[4-6]和LC-MS/MS[7-10]等方法，串聯(lián)質(zhì)譜法雖然靈敏度高、定性準(zhǔn)確，但儀器昂貴，日常維護(hù)保養(yǎng)較煩瑣，需要具備較專業(yè)的知識和操作水平，不適宜基層檢測機(jī)構(gòu)的日常監(jiān)控工作。本研究采用固相萃取-高效液相色譜法對牛肉中3類12種獸藥殘留進(jìn)行檢測，方法操作簡單，能夠滿足日常獸藥殘留快速風(fēng)險篩查及監(jiān)測工作的需要。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器：高效液相色譜儀（Waters公司，e2695/2998）；分析天平（METTLER TOLEDO公司，PB602-S）；高速冷凍離心機(jī)（SIGMA公司，3K15）；超聲波水?。ɡド绞谐晝x器有限公司，KQ-250DB）；固相萃取裝置（Waters公司）；氮氣吹干儀（Organomation Associates公司，N-EVAP 116）；渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，QL-901）；50mL具塞塑料離心管；微孔濾膜（0.22μm）；Oasis PRiME HLB固相萃取柱（Waters公司，6cc/200mg）。

主要試劑：乙腈、乙酸為色譜純；水為超純水；乙二胺四乙酸二鈉為分析純。0.1mol/L EDTA溶液：準(zhǔn)確稱取1.86g乙二胺四乙酸二鈉加純水30mL超聲溶解，定容至50mL。

磺胺類標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺嘧啶（SD）、磺胺甲基異噁唑（SMZ）、磺胺二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺甲氧噠嗪（SMP）、磺胺喹噁啉（SQ）、磺胺二甲嘧啶（SM2）來源Dr. Ehrenstorfer Gmbh，磺胺間甲氧嘧啶（SMM）來源中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；四環(huán)素類標(biāo)準(zhǔn)品：金霉素（CTC）、土霉素（OTC）、四環(huán)素（TC）、多西環(huán)素（DC）來源Dr. Ehrenstorfer Gmbh；氯霉素（CAP）標(biāo)準(zhǔn)品，來源中國食品藥品檢定研究院，用乙腈溶解配制成濃度為10.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，臨用時準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液用流動相稀釋成適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 樣品處理

1.2.1 提取 準(zhǔn)確稱取5.00g均質(zhì)后的牛肉樣品，置于50ml具塞塑料離心管中，分別加入1.0ml0.1mol/L EDTA溶液和10ml含1%乙酸的乙腈溶液，充分渦旋混勻后，超聲波提取30min，以10000 r/min離心5min。

1.2.2 凈化 取上清液1.0ml淋洗Oasis PRiME HLB固相萃取柱，流出液棄去。再加入上清液5.0ml過Oasis PRiME HLB固相萃取柱，收集流出液，于45℃用氮氣吹干，殘留物用0.5ml初始流動相定容，渦旋混合1min，過0.22μm微孔濾膜后作為試樣溶液，供HPLC測定。

同時作空白樣品的處理，均按上述測定條件和步驟進(jìn)行平行操作。

1.3 HPLC測定條件

色譜柱：XTerra?MS C18，5μm，250mm×4.6mm column；流動相：A相為乙腈，B相為0.2%乙酸溶液；梯度洗脫程序：0～5min，10%A；5～15min，10%～15%A；15～25min，15%～20%A；25～40min，20%A；40～50min，20%～10%A；50～60min，10%A；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：50μl；檢測器：二極管陣列檢測器，波長范圍：210nm到400nm。

1.4 添加回收率、檢測限（LOD）和精密度的確定

取空白牛肉樣品5.00g，加入一定體積的混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液，使在樣品中的磺胺類、氯霉素濃度分別為0.02、0.04、0.10mg/kg、四環(huán)素類濃度分別為0.05、0.1、0.25mg/kg；另取空白牛肉樣品，不添加標(biāo)準(zhǔn)工作液。添加與空白均按上述樣品前處理方法進(jìn)行處理，作HPLC測定。再將相對應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液作HPLC測定分析，計算各對應(yīng)質(zhì)量濃度的回收率。各空白樣品測得基線噪音值，按信噪比S/N≥3為檢測限。每個濃度點進(jìn)行5個平行樣品的測試，3次重復(fù)，根據(jù)色譜峰峰面積分別計算各濃度點的添加回收率、變異系數(shù)及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取劑的優(yōu)化

甲醇和乙腈[10～12]是常用于獸藥多殘留檢測的有機(jī)溶劑。本實驗考察了乙腈、甲醇、1%乙酸-乙腈溶液等提取液。結(jié)果表明，使用乙腈提取效果好于甲醇提取液。四環(huán)素類藥物易與組織中的金屬離子絡(luò)合，以及與組織中的蛋白強(qiáng)烈結(jié)合。提取時加入1.0mL0.1mol/L EDTA溶液，能避免四環(huán)素類藥物因絡(luò)合而造成回收率降低[13-14]。本文采用含1%乙酸的乙腈溶液作為提取液能最大限度提取出有效成分并使共萃取的干擾物較少，添加回收結(jié)果理想，回收率穩(wěn)定。

2.2 樣品凈化條件的優(yōu)化

樣品凈化采用了極性吸附原理的固相萃取柱，使用通過策略進(jìn)行固相萃取凈化。PRiME HLB固相萃取柱是在HLB親水親脂平衡的水可浸潤性的反相吸附劑的基礎(chǔ)上，能有效去除樣品中的蛋白、磷脂、維生素和礦物質(zhì)等基質(zhì)干擾物，不影響吸附劑床的干涸，無須活化，直接上樣，簡化了實驗步驟，對復(fù)雜基質(zhì)能達(dá)到較好的凈化效果[15]。

2.3 液相色譜檢測

采用本試驗中樣品處理方法，在上述色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品和試樣溶液的高效液相色譜圖分別見圖1、圖2、圖3。通過圖譜分析可知，本法中各組分出峰時間較穩(wěn)定，干擾雜質(zhì)較少。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 空白樣品色譜圖

圖3 空白添加色譜圖

2.4 線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢測限

在本方法確定的實驗條件下，采用空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)工作液的方法制備標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，磺胺類和氯霉素添加濃度為0.02、0.04、0.08、0.10、0.20mg/kg、四環(huán)素類濃度分別為0.05、0.1、0.20、0.50、1.0mg/kg，每個濃度點進(jìn)行5個平行樣品的實驗，分別進(jìn)樣用平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得的各組分的線性范圍、相關(guān)系數(shù)及方法檢測限（S/N≥3）見表1。

表1 牛肉中12種化合物線性范圍、相關(guān)系數(shù)、方法檢測限、平均回收率及精密度

2.5 方法的添加回收率和精密度

本研究建立的牛肉樣品中12種藥物殘留檢測方法，平均回收率為51%～133%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20%。平均回收率和精密度結(jié)果見表1。

3 結(jié)論

本研究采用通過固相萃取前處理，高效液相色譜法檢測，樣品操作簡單、快速、凈化效果好，縮短了檢測周期，節(jié)約了檢測成本，準(zhǔn)確度和精密度好，可用于多種藥物在牛肉中殘留檢測，為基層檢測機(jī)構(gòu)提供了簡單快速的篩選方法，有助于應(yīng)對多殘留檢測的日常監(jiān)控。