CUL4A、VEGF及N?cadherin在膽管癌中的表達和臨床意義

夏修良 薛棟 董雪

濱州市人民醫(yī)院1普外一科，2醫(yī)院辦公室（山東濱州 256610）

膽管癌是指起源于膽管上皮細胞的惡性腫瘤，早期診斷率低，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和神經(jīng)浸潤，且對放化療敏感性較低，膽管癌患者的自然病程約6個月到1年［1］。因此，臨床上急切需要探索膽管癌惡性侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制，以找尋高效的預后分子標志物，這對于提升膽管癌的總體臨床治療效果、降低腫瘤致死率具有極其重要的意義。CUL4A（cullin 4A）是新發(fā)現(xiàn)的一種CRLs（cullin?ringbased E3?ligases）泛素連接酶，定位于13q34染色體，CUL4A在多種惡性腫瘤中有高表達，并可作為腫瘤預后的獨立因素［2］。沉默卵巢癌細胞中CUL4A基因后，腫瘤細胞的侵襲及遷移能力受到明顯抑制［3］。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endotheliar growth factor，VEGF）在調(diào)控血管內(nèi)皮增殖及遷移等過程中起重要作用［4］。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是促進腫瘤細胞侵襲及轉(zhuǎn)移的中心事件。N-鈣黏蛋白（N?cadherin）是EMT發(fā)生過程中的一個重要分子［5］。目前，關于CUL4A、VEGF和N?cadherin在膽管癌組織中的研究文獻報道較少。本實驗應用實時熒光定量 PCR（quantitativereal?time PCR，qRT?PCR）技術和免疫組化方法檢測膽管癌組織中CUL4A與VEGF、N?cadherin的表達，并探討其在膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2008年1月至2014年1月濱州市人民醫(yī)院72例膽管癌臨床標本，病理證實均為腺癌。男50例，女22例；年齡35～77歲；高分化為31例，中分化為22例，低分化為19例；腫瘤位于肝門部31例，膽總管41例；淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移37例，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例。選取同一個期間36例正常膽管組織（肝內(nèi)膽管結(jié)石行半肝切除或肝部分切除病例）作為對照組。另外，筆者還收集了2011年2月至2013年12月35例新鮮膽管癌和15例正常膽管（肝內(nèi)膽管結(jié)石行左肝外葉切除病例）手術切除標本，立即置于-80℃冰箱或液氮罐中保存。所有病患術前均沒有接受放化療、分子靶向等治療。依據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）制定的臨床TNM分期標準（第七版）：符合Ⅰ期為15例，Ⅱ期為25例，Ⅲ期為19例，Ⅳ期為13例。術后隨訪主要通過門診復診、電話、網(wǎng)絡及信件等方式進行，中位隨訪時間48個月。

1.2qRT?PCR檢測新鮮標本中CUL4A mRNA的表達 Trizol購買于Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒均購買于Takara公司。按Trizol說明書分別抽提膽管癌組織與正常膽管組織中總RNA?？俁NA隨即被逆轉(zhuǎn)錄成cD?NA。CUL4A引物序列為：上游引物5′?TACGAGT?GGGACTAGATGTA?3′，下游引物 5′?GGCTCAGAG?GTATTGACATC?3′；β?actin作為內(nèi)參對照，β?actin引物序列為：上游引物5′?AGCGAGCATCCTCCAA?AGTT?3′，下游引物5′?GTGCACGAAGGCTCATCA?AT?3′。PCR 反應體系為 20 μL，反應條件如下：95℃變性1 min；95℃變性10 s；55℃退火15 s，75℃延伸5 min，一共50個循環(huán)；然后進行溶解曲線分析。應用2-ΔΔCt法進行定量分析待測基因mRNA的表達。

1.3 試劑和方法 選取我院病理科存檔的膽管癌組織蠟塊，分別實施CUL4A、VEGF和N?cadherin免疫組織化學染色。采用EnVision法檢測CUL4A、VEGF和N?cadherin蛋白的表達。羊抗CUL4A、兔抗VEGF、兔抗N?cadherin多克隆抗體購自Santa Cruz公司，工作濃度均為1∶200。鼠抗羊、鼠抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。Envision試劑盒購買于Dako公司，嚴格遵照試劑盒的使用說明書來操作。同時設立陽性和陰性對照：試劑公司提供的強陽性標本切片視為陽性對照，磷酸鹽緩沖液代替一抗視為陰性對照。

1.4 免疫組化結(jié)果判定 CUL4A、VEGF陽性均定位于細胞質(zhì)，N?cadherin陽性定位于細胞膜。在不知任何背景資料的情形下，由兩位高年資病理科專業(yè)醫(yī)師采用雙盲法進行評定。首先依據(jù)染色的強度打分：0分（無陽性染色）；1分（淡黃色）；2分（棕黃色）；3分（棕褐色）。然后將陽性細胞所占的百分比算分：0分（無陽性細胞）；1分（1%～25%）；2分（26%～50%）；3分（51%～75%）；4分（76%～100%）。最后將染色的強度與陽性細胞百分比的乘積統(tǒng)計總分數(shù)，記分≥4分視為免疫反應陽性，記分＜4分視為免疫反應陰性。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，非配對t檢驗用于分析膽管癌和正常膽管中CUL4A mRNA表達的差異。計數(shù)資料采用χ2檢驗，等級相關檢驗采用Spearman相關檢驗，生存曲線應用Kaplan?Meier法繪制，Log rank方法對組間生存率進行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CUL4A mRNA在膽管癌組織中表達上調(diào)實時熒光定量PCR分析了35例膽管癌和15例正常膽管組織CUL4A mRNA的表達水平，結(jié)果表明CUL4A mRNA在膽管癌組織中表達量是3.876±0.975，明顯高于正常膽管組織的表達量1.216±0.265，差異有統(tǒng)計學意義（圖1，P＜0.001）。

2.2 CUL4A、VEGF和N?cadherin蛋白在膽管癌組織和正常膽管組織中的表達 CUL4A主要表達于細胞質(zhì)，染色呈棕褐色顆粒（圖2）。VEGF主要表達于細胞質(zhì)，染色呈棕黃色的顆粒（圖3）。N?cadherin主要表達于細胞膜，呈棕黃色顆粒（圖4）。CUL4A蛋白在膽管癌組織及正常膽管組織中的表達率分別為70.8%、2.8%（P＜0.05）。膽管癌組織及正常膽管組織中VEGF蛋白的陽性表達率分別為66.7%、8.3%（P＜0.05）。N?cadherin蛋白在膽管癌組織中及正常膽管組織中的表達率分別為58.3%、12.5%（P＜0.05）。見表1。

圖1 CUL4A mRNA在膽管癌組織中和正常膽管組織中的表達Fig.1 Expression of CUL4A mRNA in cholangiocarcinoma tissues and normal bile tissues

圖2 CUL4A陽性染色（免疫組化染色，EnVision×200）Fig.2 The positive plasma staining of CUL4A（EnVision×200）

圖3 VEGF陽性染色（免疫組化染色，EnVision×200）Fig.3 The positive plasma staining of VEGF（EnVision × 200）

2.3 CUL4A、VEGF和N?cadherin蛋白表達與膽管癌臨床病理特征的關系 CUL4A、VEGF和N?cadherin陽性表達均與患者的性別、年齡、CA199水平、腫瘤大小、所在部位無關（均P＞0.05，表2）。CUL4A、VEGF和N?cadherin蛋白陽性率隨著腫瘤分化差、血管侵犯、神經(jīng)浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床TNM分期升高而增加（均P＜0.05，表2）。CUL4A、VEGF和N?cadherin共同促進了膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移。

圖4 N?cadherin陽性染色（免疫組化染色，EnVision×200）Fig.4 The positive membrane staining of N?cadherin（EnVision×200）

表1 膽管癌和正常膽管組織中CUL4A、VEGF及N?cadherin表達的比較Tab.1 Immunohistochemical results of CUL4A、VEGF and N?cadherin in cholangiocarcinoma and normal bile tissues例

2.4 CUL4A、VEGF和N?cadherin在膽管癌組織中表達的相關性 Spearman等級檢驗分析表明，膽管癌組織中CUL4A和VEGF蛋白表達呈正相關（r=0.415，P=0.043），CUL4A和N?cadherin的表達也呈正相關（r=0.464，P=0.036）；N?cadherin與VEGF的表達也呈正相關（r=0.508，P=0.027）。

2.5 生存分析 對患者分組（根據(jù)免疫組化結(jié)果）后進行生存分析，CUL4A陽性組患者的生存時間顯著短于陰性組患者，3年的生存率分別是44%、67%，患者5年的生存率分別是13%、32%，CUL4A陽性的患者生存時間較陰性患者縮短，差異有顯著性（P＜0.05）（圖5）。VEGF陽性和陰性的患者3年的生存率、5年的生存率差異均無顯著性（P＞0.05）。N?cadherin陽性和陰性患者3年生存率、5年生存率差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

泛素化是指泛素在一些催化酶協(xié)同下對靶蛋白進行修飾，它不僅參與細胞增殖、凋亡和分化等，還在腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移等過程中起關鍵作用。CUL4A在人類的很多惡性腫瘤中存在高表達，其高表達往往與腫瘤侵襲、臨床分期及預后明顯相關［6-8］。結(jié)直腸癌組織中CUL4A蛋白存在高表達，而且其與腫瘤的大小、分化程度及區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關；另外，干擾CUL4A基因后腫瘤細胞的增殖及侵襲力下降［9］。本實驗首先采用實時熒光定量PCR和免疫組化技術檢測了CUL4A在膽管癌與膽管組織中的表達，發(fā)現(xiàn)膽管癌組織中CUL4A mRNA和蛋白均高表達。筆者還發(fā)現(xiàn)CUL4A表達與腫瘤分化程度、血管侵犯、神經(jīng)浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床TNM分期密切有關。CUL4A陽性患者5年生存率較陰性患者明顯縮短，提示CUL4A陽性膽管癌患者的預后差。本研究結(jié)果表明，CUL4A與膽管癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移和臨床預后明顯相關，其有望成為膽管癌的靶向治療基因。

表2 CUL4A、VEGF及N?cadherin表達與膽管癌臨床病理參數(shù)的關系Tab.2 Relation between the expression of CUL4A、VEGF and N?cadherin protein and the clinicopathological features of cholangiocarcinoma例

圖5 72例膽管癌患者CUL4A表達和生存時間的關系Fig.5 Differential expression of CUL4A from 72 cholangiocarcinoma patients and survival rate

腫瘤生長離不開豐富的血液供應，VEGF不僅增加腫瘤組織內(nèi)微小血管的通透性，還能促進小血管新生［10］。VEGF還與惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和預后密切相關［11］。本研究結(jié)果顯示，膽管癌組織中VEGF蛋白存在高表達，還與腫瘤分化、血管侵犯、神經(jīng)浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床TNM分期有關，提示VEGF在膽管癌惡性侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。膽管癌中CUL4A與VEGF的表達存在正相關，推測CUL4A可能通過調(diào)節(jié)VEGF表達促進膽管癌組織中血管新生。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤獲得侵襲和遷移的重要分子機制。當N?cadherin表達明顯增加致細胞之間的黏附力降低，導致腫瘤細胞局部侵襲和遠處轉(zhuǎn)移［12］。EMT是膽管癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的一個關鍵步驟［13］。敲除前列腺腫瘤細胞N?cadherin基因后，癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移力顯著下降［14］。本研究結(jié)果顯示，膽管癌組織中N?cadherin存在高表達，其高表達伴隨腫瘤分化差、神經(jīng)浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期較晚。

綜上所述，CUL4A基因在膽管癌中的臨床應用價值得期待，即CUL4A有可能成為膽管癌分子標記物和治療靶點，鑒于此，下一步需要開展更深入分子機制研究。