腫瘤抑制基因PTEN對體外活化肝星狀細胞骨架蛋白vinculin的影響

郝禮森 張明婷 王玉蘭 宋小杰 宋潔 章廣玲 莫艷波 靳麗敏張朋壘

1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（河北唐山 063000）；2華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（河北唐山 063000）

肝纖維化是肝臟對各種損傷產(chǎn)生的修復(fù)反應(yīng)，持續(xù)發(fā)展可演變?yōu)楦斡不６涡菭罴毎╤epatic stellate cell，HSC）則是肝纖維化病理過程中的最重要的細胞。當(dāng)肝臟受到損傷因子刺激時，HSC活化為肌成纖維細胞，并向損傷區(qū)域遷移，產(chǎn)生大量以膠原為主的細胞外間質(zhì)，導(dǎo)致肝纖維化的形成與發(fā)展［1］。因此，活化HSC的遷移在肝纖維化病理過程中發(fā)揮重要作用。已有研究證實細胞遷移與細胞骨架的重構(gòu)有關(guān)［2-3］，而細胞骨架是由微絲、微管及中間纖維組成的蛋白纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中微絲是由肌動蛋白（actin）構(gòu)成的螺旋狀纖維。Actin作為構(gòu)成微絲的重要骨架蛋白，其功能除了參與維持細胞的正常形態(tài)外，還參與對細胞黏附、遷移的調(diào)控［4］。紐蛋白（vinculin）是一種與黏著連接形成有關(guān)的細胞骨架蛋白，存在于細胞-細胞及細胞間質(zhì)間的黏著部位，因此也是一種黏著斑蛋白，其作用是將纖維狀肌動蛋白（filamentous actin，F(xiàn)?actin）錨著于連接點形成部位的細胞膜上，通過與多種細胞骨架蛋白、黏著斑蛋白相互作用，在細胞黏附、遷移、增殖等過程中發(fā)揮重要作用［5-6］。第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homology detected on chromosome ten，PTEN）是第一個被發(fā)現(xiàn)的具有雙重磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，其突變或表達缺失與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［7］。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，膽總管結(jié)扎肝纖維化大鼠肝組織及在體肝星狀細胞的PTEN表達降低［8］；并且體外研究發(fā)現(xiàn)，野生型PTEN過表達可顯著抑制體外活化大鼠肝星狀細胞骨架的重構(gòu)及細胞骨架蛋白F?actin的形成［9］，而PTEN表達下調(diào)則可明顯促進體外活化大鼠肝星狀細胞骨架的重構(gòu)及細胞骨架蛋白F?actin的形成［10］。但PTEN表達變化對活化肝星狀細胞骨架蛋白vinculin的影響仍不清楚。為此，本研究以活化大鼠肝星狀細胞系HSC?T6為研究對象，分別將攜帶野生型PTEN基因及靶向PTEN的RNA干擾序列短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）的重組腺病毒 Ad?PTEN及Ad?shRNA/PTEN轉(zhuǎn)染體外活化大鼠HSC，構(gòu)建體外活化大鼠肝星狀細胞PTEN過表達及低表達模型，應(yīng)用免疫熒光法檢測了PTEN過表達及低表達對體外活化肝星狀細胞骨架蛋白vinculin的影響，以期為深化對肝纖維化病理生理機制的認識提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 帶有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因并攜帶野生型PTEN基因的重組腺病毒（Ad?PTEN）及僅攜帶GFP基因的空病毒（Ad?GFP）由祝善俊教授（第三軍醫(yī)大學(xué)）惠贈，帶有GFP基因并攜帶靶向PTEN的shRNA的重組腺病毒（Ad?shRNA/PTEN）由浙瑪生物技術(shù)公司（武漢）協(xié)助構(gòu)建。表型活化的大鼠肝星狀細胞系HSC?T6（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院）；胎牛血清及山羊血清（以色列Biological Industries公司）；DMEM培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；兔抗vinculin單克隆抗體（美國Affinity公司）；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的羊抗兔IgG（美國KPL公司）；DAPI及TritonX?100（美國Sigma公司）；熒光防淬滅封片劑（美國Bioworld公司）；Platinum SYBR Green qPCR SuperMix?UDG、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（上海英俊生物技術(shù)有限公司）。

1.2 腺病毒轉(zhuǎn)染體外活化肝星狀細胞 以含8%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)HSC?T6，細胞生長至80%融合時，按感染倍數(shù)100進行腺病毒轉(zhuǎn)染，并于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，2 h后補充適量完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至實驗所需時間。分別于倒置熒光顯微鏡下在腺病毒感染肝星狀細胞12、24、48、72 h觀察HSC的熒光表達、計算轉(zhuǎn)染效率。腺病毒感染肝星狀細胞48 h轉(zhuǎn)染效率＞80%，并且48與72 h GFP陽性表達的HSC數(shù)量無明顯差異，但72 h細胞脫落現(xiàn)象更廣泛，表明腺病毒感染肝星狀細胞48 h轉(zhuǎn)染效率已達到最高，故后續(xù)實驗僅采用腺病毒感染48 h的HSC。實驗分組：（1）Control組：以無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)液代替腺病毒液轉(zhuǎn)染體外活化HSC；（2）Ad?GFP組：以僅帶有GFP基因的載體空病毒Ad?GFP轉(zhuǎn)染體外活化HSC；（3）Ad?PTEN組：以帶有GFP基因并攜帶野生型PTEN基因的重組腺病毒 Ad?PTEN 轉(zhuǎn)染體外活化HSC；（4）Ad?shRNA/PTEN組：以帶有GFP基因并攜帶靶向PTEN的shRNA的重組腺病毒Ad-shRNA/PTEN轉(zhuǎn)染體外活化HSC。

1.3 實時熒光定量PCR檢測體外活化肝星狀細胞的PTEN mRNA表達 腺病毒感染肝星狀細胞48 h，收集各組肝星狀細胞，依照TRizol試劑盒說明提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。目地基因PTEN與內(nèi)參照3?磷酸甘油醛脫氫酶（glyseralde?hyde?3?phosphate dehydrogenase，GAPDH） 基因引物由上海生工生物公司合成。引物序列：PTEN的上游引物為 5′?TCCTGCAGAAAGACTTGAAGGT?3′，下游引物為 5′?GCTGTGGTGGGTTATGGTCT?3′，擴增產(chǎn)物大小為182 bp；GAPDH的上游引物為5′?GGCTCATGACCACAGTCCAT?3′，下游引物為 5′?ACATTGGGGGTAGGAACACG?3′，擴增產(chǎn)物大小為202 bp。在Master cycler ep Real Plex4實時熒光定量PCR儀上進行擴增。采用相對定量2?△△Ct法比較各組HSC的PTEN mRNA表達差異［11］。

1.4 免疫熒光法檢測體外活化肝星狀細胞的vinculin表達 腺病毒感染肝星狀細胞48 h，將上述各組肝星狀細胞的培養(yǎng)液吸凈，用PBS清洗細胞2次，并加入4%多聚甲醛室溫下固定10 min，再吸去多聚甲醛并用PBS清洗3次（每次10 min）、加入0.5%TritonX?100室溫下透膜處理5 min；經(jīng)透膜處理后，細胞于室溫條件下用PBS清洗3次（每次10 min），滴加山羊血清，室溫下封閉1 h；吸去封閉液，滴加一抗兔抗vinculin單克隆抗體（1∶200稀釋）于4℃下過夜；于次日用PBS清洗細胞4次（每次5 min）；加入熒光二抗（FITC標記的羊抗兔IgG），于室溫下孵育1 h；PBS清洗3次（每次5 min），用DAPI溶液（濃度5 mg/L）復(fù)染細胞核30 s，用PBS清洗細胞，在共聚焦小皿底部滴加熒光防淬滅甘油，并立即置于激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal micro?scope，LSCM）下觀察，隨機選取6個視野進行熒光圖像分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建體外活化大鼠HSC的PTEN過表達及低表達模型 應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測各組HSC的PTEN mRNA表達，Control組HSC的PTEN mRNA 表達量認定為 1，則 Ad?GFP組、Ad?PTEN組及Ad?shRNA/PTEN組HSC的PTEN mRNA相對Control組的表達倍數(shù)分別為0.92倍、1.90倍、0.64倍。很明顯Ad?PTEN組HSC的PTEN mRNA表達量明顯高于Control組及Ad?GFP組（P＜ 0.05），而Ad?shRNA/PTEN組 HSC的 PTEN mRNA表達量則顯著低于Control組及Ad?GFP組（P＜0.05），但Control組與Ad?GFP組之間HSC的PTEN mRNA表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。上述結(jié)果表明外源性野生型PTEN基因和靶向PTEN的shRNA分別成功轉(zhuǎn)染體外活化大鼠HSC，并在HSC內(nèi)大量表達，體外活化大鼠HSC的PTEN過表達及低表達模型均成功構(gòu)建（表1）。

表1 實時熒光定量PCR顯示腺病毒感染HSC 48 h各組HSC的PTEN mRNA相對表達Tab.1 PTEN mRNA expression of HSC in each group at 48 h after adenovirus infection ±s

表1 實時熒光定量PCR顯示腺病毒感染HSC 48 h各組HSC的PTEN mRNA相對表達Tab.1 PTEN mRNA expression of HSC in each group at 48 h after adenovirus infection ±s

注：△△Ct=腺病毒轉(zhuǎn)染組 △Ct（CtPTEN－CtGAPDH）－Control組 △Ct（CtPTEN－CtGAPDH）；*P＜0.05，與Control組及Ad?GFP組比較

組別Control組Ad?GFP 組Ad?PTEN 組Ad?shRNA/PTEN 組ΔCt 8.070±0.108 8.183±0.123 7.137±0.072 8.723±0.115 ΔΔCt 0 0.113-0.933 0.653 PTENmRNA相對表達量（2-ΔΔCt）1 0.92 1.90*0.64*

2.2 野生型PTEN過表達對體外活化大鼠HSC vinculin的影響 肝星狀細胞經(jīng)染色后，于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，可見細胞內(nèi)vinculin被激發(fā)出黃綠色熒光，主要表達于胞漿。Ad?PTEN組HSC的vincuin熒光強度較Control組及Ad?GFP組HSC的vincuin熒光強度顯著降低（P＜0.05），Control組與Ad?GFP組之間HSC的vinculin熒光強度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而HSC的vincuin亞細胞分布在各組HSC無明顯變化（表2、圖1）。

2.3 下調(diào)PTEN表達對體外活化HSC vinculin的影響 肝星狀細胞經(jīng)染色后，于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，可見細胞內(nèi)vinculin被激發(fā)出黃綠色熒光。Ad?shRNA/PTEN組HSC的 vincuin熒光強度較Control組及Ad?GFP組HSC的 vincuin熒光強度顯著增加（P＜0.05），而HSC的vincuin亞細胞分布未發(fā)生明顯變化，主要表達于細胞漿（表2、圖1）。

表2 腺病毒感染HSC 48 h各組HSC的vinculin熒光強度Tab.2 The fluorescence intensity of vinculin in HSC at 48 hours after adenovirus infection（n=6） ± s

表2 腺病毒感染HSC 48 h各組HSC的vinculin熒光強度Tab.2 The fluorescence intensity of vinculin in HSC at 48 hours after adenovirus infection（n=6） ± s

注：與Control組及Ad?GFP組比較，*P＜0.05

組別Control組Ad?GFP 組Ad?PTEN 組Ad?shRNA/PTEN 組Vinculin熒光強度381.13±9.12 383.87±12.15 251.78±12.68*770.77±20.12*

3 討論

圖1 LSCM下顯示腺病毒感染HSC 48 h各組HSC的vinculin熒光表達及分布（×200）Fig.1 The expressions of vinculin in HSC were observed under LSCM at 48 hours after adenovirus infection（× 200）

細胞骨架是一種蛋白纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，位于真核細胞核和細胞膜內(nèi)側(cè)面，由微絲、微管和中間纖維組成。細胞骨架的功能除了參與細胞形態(tài)的維持，還參與對細胞黏附、遷移、增殖、凋亡等的調(diào)控［4］。細胞骨架功能的完成與構(gòu)成它的骨架蛋白密切相關(guān)，其中組成微絲的主要成份actin是完成細胞骨架功能不可缺少的重要骨架蛋白。而vinculin則是另一重要的細胞骨架蛋白，其由8個α螺旋束組成，存在于細胞—細胞及細胞間質(zhì)間的黏著部位，因此也是一種黏著斑蛋白。Vinculin的功能與黏著連接形成有關(guān)，它可將F?actin錨著于連接點形成部位的細胞膜上，通過與多種細胞骨架蛋白及黏著斑蛋白相互作用，參與細胞黏附、伸展、遷移、增殖、存活等的調(diào)控［5-6］。

眾所周知，肝纖維化是肝臟對各種損傷產(chǎn)生的修復(fù)反映，HSC是參與肝纖維化病理過程中的最重要細胞。在肝纖維化過程中，活化HSC向肝損傷部位遷移，導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)域活化HSC的數(shù)量增多，進而促進肝纖維化的發(fā)展。如上所述，細胞骨架，尤其是細胞骨架蛋白F?actin及vinculin與細胞遷移有關(guān)。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，在多種組織及細胞中廣泛表達的腫瘤抑制基因PTEN表達下調(diào)可顯著促進體外活化肝星狀細胞的遷移［12］，并明顯促進體外活化肝星狀細胞骨架的重構(gòu)及細胞骨架蛋白F?actin的形成［10］；而野生型PTEN過表達則可顯著抑制體外活化肝星狀細胞骨架的重構(gòu)及細胞骨架蛋白F?actin的形成［9］。但PTEN 表達變化對體外活化肝星狀細胞骨架蛋白vinculin的影響尚不清楚。為此，本研究應(yīng)用腺病毒瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)，將野生型PTEN基因及靶向PTEN的shRNA分別轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的活化HSC，在證實活化HSC的PTEN過表達及低表達模型成功構(gòu)建后，應(yīng)用免疫熒光法檢測了PTEN過表達及低表達對體外活化肝星狀細胞骨架蛋白vinculin的影響。結(jié)果顯示，野生型PTEN過表達可顯著抑制體外活化肝星狀細胞骨架蛋白vinculin的表達，而PTEN低表達則可上調(diào)活化肝星狀細胞骨架蛋白vinculin的表達，但PTEN表達變化對體外活化HSC的vinculin亞細胞分布無明顯影響。結(jié)合我們前期的研究發(fā)現(xiàn)膽總管結(jié)扎肝纖維化大鼠肝組織及在體肝星狀細胞的PTEN表達降低［8］，體外研究發(fā)現(xiàn)PTEN表達下調(diào)可顯著促進體外活化肝星狀細胞的遷移［12］，以及有研究發(fā)現(xiàn)在大鼠肝纖維化進程中其纖維化肝組織的vinculin表達上調(diào)［13］，本研究結(jié)果提示在肝纖維化病程中PTEN表達下調(diào)可能通過使活化HSC的vinculin表達上調(diào)，進而促進活化HSC的遷移參與肝纖維化病理過程。如PTEN過表達則可通過下調(diào)活化HSC的vinculin表達抑制活化HSC的遷移，進而抑制肝纖維化的發(fā)展。但本研究為體外實驗，僅對體外活化HSC的PTEN表達變化對其vinculin的影響進行了探討，而在體HSC的PTEN表達變化對其vinculin的影響仍不清楚，并且盡管我們前期的研究已發(fā)現(xiàn)PTEN過表達可通過抑制絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶B（serine?threo?nine protein kinase B，Akt）及黏著斑激酶（focal ad?hesion kinase，F(xiàn)AK）的磷酸化而抑制體外活化HSC的磷脂酰肌醇?3 激酶（phosphoinositol?3?kinase，PI3K）/Akt及FAK信號通路［14-15］，但上述信號通路是否參與了PTEN對HSC的vinculin調(diào)控仍需進一步探討，這些問題均是下一步的研究方向。