米非司酮對(duì)稽留流產(chǎn)患者血清和絨毛組織中Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6表達(dá)水平的影響

鄭 燕，王 娜，吳命坤，劉靜喬，孟亞麗

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050031)

稽留流產(chǎn)是指胚胎或胎兒已死亡滯留宮腔內(nèi)不能及時(shí)自然排出，是流產(chǎn)中的一種特殊類型[1]。導(dǎo)致稽留流產(chǎn)發(fā)生的人群主要有室外職業(yè)者、初產(chǎn)婦、自然流產(chǎn)病史患者、貧血和乙肝病毒攜帶者，環(huán)境因素和其他未知因素也是稽留流產(chǎn)發(fā)生的重要原因[2]。研究[3-5]表明：在妊娠過(guò)程中，受精卵著床到胎盤形成過(guò)程與新血管的生成有密切關(guān)系，血管生成素(angiopoietin，Ang)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)參與該過(guò)程。對(duì)于稽留流產(chǎn)的治療，目前臨床上主要以米非司酮聯(lián)合米索前列醇終止妊娠，該方法具有臨床療效好和藥物不良反應(yīng)少等特點(diǎn)[6]。目前對(duì)米非司酮終止稽留流產(chǎn)的具體機(jī)制尚未明確，關(guān)于Ang和VEGF在稽留流產(chǎn)患者血清中的表達(dá)和相關(guān)性研究較少。本研究通過(guò)觀察米非司酮對(duì)68例稽留流產(chǎn)患者血清和絨毛組織中Ang-1、Ang-2和VEGF表達(dá)水平的影響，并檢測(cè)細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)的表達(dá)情況，闡明米非司酮終止稽留流產(chǎn)的作用機(jī)制，為臨床上應(yīng)用米非司酮終止稽留流產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年3月—2017年3月在本院就診的孕10～16周的稽留流產(chǎn)患者68例作為藥流組，年齡20～39歲，停經(jīng)10～16周。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡20～40歲，平時(shí)月經(jīng)規(guī)律；②夫妻雙方染色體核型無(wú)異常；③經(jīng)B超檢查提示胚胎已停止發(fā)育，胎死宮中，子宮體積均不同程度小于孕周；④無(wú)內(nèi)分泌異常；⑤無(wú)血栓形成傾向；⑥排除免疫因素和感染因素影響。選擇自愿要求終止妊娠的孕10～16周正常妊娠者51例為對(duì)照組，年齡20～38歲，停經(jīng)時(shí)間10～16周。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡20～40歲，平時(shí)月經(jīng)規(guī)律；②既往正常分娩史且無(wú)不良孕產(chǎn)史；③此次孕期無(wú)腹痛、陰道流血和其他不適，未保胎治療；④B超檢查提示胎兒存活，子宮大小與孕周相符。均自愿要求終止妊娠。所有入選者血尿常規(guī)、肝功能和凝血功能正常，無(wú)子宮畸形及其研究對(duì)象內(nèi)外科并發(fā)癥，無(wú)米索前列醇應(yīng)用禁忌證。以上研究對(duì)象在年齡、孕周、孕次和產(chǎn)次等方面比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 分組和給藥 對(duì)照組研究對(duì)象于手術(shù)前1 d抽取靜脈血，第2天采用常規(guī)負(fù)壓吸引流產(chǎn)，手術(shù)后收集靜脈血和絨毛。藥流組患者給藥前1 d抽取靜脈血，于第 2天19：00、第3天7：00、19：00分別口服給予米非司酮50 mg，第4天8：00口服給予米索前列醇600 μg，于同一天抽取靜脈血，觀察宮縮、妊娠物排出情況、陰道出血量和不良反應(yīng)等，孕囊排出后即刻收集絨毛。

1.3 樣本的采集及制備 收集研究對(duì)象靜脈血后，靜置30 min，3 000 r·min-1離心15 min，取血清，-20℃保存。收集患者絨毛組織后，采用生理鹽水沖洗，10%甲醛溶液固定1 d 后，常規(guī)脫水，采用石蠟包埋，制作4 μm連續(xù)切片，切片于60℃下烤片2 h后行免疫組織化學(xué)染色。常規(guī)脫蠟水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗；采用羊血清工作液封閉非特異性抗原修復(fù)；分別加入Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6一抗，對(duì)照組切片以PBS代替一抗，4℃過(guò)夜。室溫孵育40 min后加入生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗IgG和底物；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。Ang-1、Ang-2和VEGF試劑盒由北京博奧森生物科技有限公司提供，TNF-α和IL-6試劑盒由武漢博士德生物工程公司提供。

1.4 ELISA法檢測(cè)血清中Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6水平 取患者血清，采用 ELISA 法檢測(cè)血清中Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6水平，于各檢測(cè)孔加入100 μL樣本溶液，加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照，孵育2 h，洗滌，加入200 μL偶聯(lián)抗體，孵育2 h，洗滌后加入200 μL底物，避光孵育30 min，加入20 μL 終止液。采用酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)測(cè)定各孔吸光度(A)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所測(cè)標(biāo)本中各檢測(cè)指標(biāo)的水平。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)絨毛組織中Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6表達(dá)水平 絨毛組織行常規(guī)免疫組織化學(xué)方法染色，切片置于顯微鏡下觀察。Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α、IL-6陽(yáng)性染色為細(xì)胞內(nèi)有棕黃色顆粒，觀察其分布及染色深淺。經(jīng)病理圖像分析系統(tǒng)(德國(guó)LEICA公司)在高倍鏡(×400)下照相，應(yīng)用Image-Pro Plus Version 6.0圖像分析軟件對(duì)每張切片的陽(yáng)性區(qū)域進(jìn)行定量檢測(cè)，測(cè)定陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物的積分吸光度(IA)值，代表Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6表達(dá)水平，染色越深，陽(yáng)性反應(yīng)越強(qiáng)，IA值越大。

2 結(jié) 果

2.1 2組研究對(duì)象臨床特征 與對(duì)照組比較，藥流組患者年齡、孕齡、孕次和產(chǎn)次比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組和藥流組研究對(duì)象臨床特征

GroupnAge(year)Gestational age(t/d)GravidityParityControl5127.9±5.287.7±10.81.3±0.20.15±0.13Drug abortion 6828.1±3.788.4±11.31.4±0.30.13±0.08

2.2 2組研究對(duì)象血清中Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6水平 與引產(chǎn)前比較，藥流組患者引產(chǎn)后血清中Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6水平明顯升高(P<0.05)。與對(duì)照組引產(chǎn)前比較，藥流組患者引產(chǎn)前血清Ang-1、Ang-2、VEGF和TNF-α水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) ，IL-6水平明顯降低(P<0.05)；與對(duì)照組引產(chǎn)后比較，藥流組患者引產(chǎn)后血清中Ang-1、Ang-2、VEGF和TNF-α水平明顯升高(P<0.05)。對(duì)照組研究對(duì)象引產(chǎn)前后血清中Ang-1、Ang-2、VEGF、 TNF-α和IL-6水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 2組研究對(duì)象引產(chǎn)前后血清中Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6 水平

Tab.2 Levels of Ang-1，Ang-2，VEGF, TNF-α,and IL-6 in serum of subjects in two groups before and after abortion

GroupnAng-1BeforeAfterAng-2BeforeAfterVEGFBeforeAfterControl5132.36±9.7031.75±7.6026.66±5.1027.47±5.9032.58±7.5030.75±5.60Drug abortion6830.18±3.8051.65±4.60?△27.65±4.1037.32±5.70?△31.81±5.1044.64±6.70?△GroupnTNF-αBeforeAfterIL-6BeforeAfterControl513.28±0.673.17±0.82 6.48±1.68 6.65±1.24 Drug abortion682.59±0.905.84±0.81?△3.17±1.04△5.67±0.51?

*P<0.05 compared with before abortion;△P<0.05 compared with control group.

2.3 2組研究對(duì)象絨毛組織中Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，藥流組患者絨毛膜組織中Ang-1、Ang-2、VEGF和TNF-α 表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)，IL-6表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1(插頁(yè)三)和表3。

2.4 相關(guān)性分析 Pearson分析結(jié)果顯示：藥流組患者血清中Ang-1水平與VEGF水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.849,P=0.012)，Ang-2水平與VEGF水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.721,P=0.026)；藥流組患者絨毛組織中Ang-1表達(dá)水平與VEGF表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.590,P=0.019)，Ang-2表達(dá)水平與VEGF表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.532,P=0.034)。見(jiàn)表4。

表3 2組研究對(duì)象絨毛組織中Ang-1、Ang-2 、VEGF、 TNF-α和IL-6表達(dá)水平

GroupnAng-1Ang-2VEGFTNF-αIL-6Control 514.25±0.612.65±0.105.61±1.612.88±0.778.84±1.95 Drug abortion6810.59±2.99?6.60±1.17?11.63±2.07?5.35±2.51?3.57±0.82?

*P<0.05 compared with control group.

表4 藥流組患者血清和絨毛組織中Ang-1和Ang-2水平與VEGF水平的相關(guān)性

Tab.4 Correlation between levels of Ang-1, Ang-2 and VEGF in serum and villus tissue of patients in drug abortion group

IndexVEGF in serumrPVEGF in villus tissuerPAng-10.8490.0120.5900.019Ang-20.7210.0260.5320.034

3 討 論

胚胎在妊娠過(guò)程中的生長(zhǎng)發(fā)育需要豐富的血液供應(yīng)所需養(yǎng)分[7]。絨毛膜的絨毛血管生成受到抑制將會(huì)導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的發(fā)生[8-9]。Ang-1、Ang-2和VEGF參與血管形成和發(fā)育，在調(diào)節(jié)血管生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。VEGF能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂，促進(jìn)新生血管的生成，并維持血管壁的完整性和通透性，在維持血管功能方面具有重要作用[10]。VEGF表達(dá)水平的變化影響胎盤血管形成和胚胎生長(zhǎng)發(fā)育。Ang包括Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4，共同調(diào)節(jié)血管生成及其穩(wěn)定性[11]。其中Ang-1和Ang-2在懷孕期間的胎盤組織中呈高表達(dá)，參與胚胎發(fā)育、胎盤血管重建和子宮內(nèi)膜周期性變化等，對(duì)女性孕期正常生殖功能的維持起重要作用[12-14]。正常情況下VEGF和Ang處于平衡狀態(tài)，VEGF刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管生成，在血管生成后期，Ang增強(qiáng)新生血管穩(wěn)定性。此外，在VEGF作用下，Ang-2可拮抗Ang-1促血管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，消除血管基底膜和管周細(xì)胞對(duì)血管形成限制，增加內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)VEGF的敏感性，更有利于血管的出芽和生長(zhǎng)[13]。VEGF、Ang-1和Ang-2水平變化會(huì)導(dǎo)致血管過(guò)度生成或抑制血管系統(tǒng)使血管退化，導(dǎo)致血管新生發(fā)生障礙，使胚胎著床失敗或妊娠并發(fā)癥的發(fā)生[14]。

TNF-α和IL-6是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的細(xì)胞活性因子，TNF-α屬于Th1型細(xì)胞因子，主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生；IL-6屬于Th2型細(xì)胞因子，孕期子宮內(nèi) IL-6主要來(lái)源于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，能夠通過(guò)減少機(jī)體免疫反應(yīng)抑制母體排斥，更利于母體維持妊娠[15]。母體正常妊娠機(jī)體中Th2型細(xì)胞因子水平占優(yōu)勢(shì)，稽留流產(chǎn)的發(fā)生與Th1/Th2失衡有一定聯(lián)系[16-18]。本研究結(jié)果顯示：藥流組患者給藥后，血清中TNF-α水平明顯高于給藥前，且絨毛組織中TNF-α表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，與文獻(xiàn)[19]結(jié)果一致。本文作者認(rèn)為：米非司酮能促進(jìn)免疫細(xì)胞分泌TNF-α等炎性因子，誘導(dǎo)流產(chǎn)發(fā)生，終止稽留流產(chǎn)；藥流組患者給藥前血清IL-6水平明顯低于對(duì)照組，可能是由于IL-6水平降低，抑制胚胎絨毛組織血管生成，導(dǎo)致缺氧損傷滋養(yǎng)層細(xì)胞和胎兒發(fā)育，是引發(fā)稽留流產(chǎn)原因之一；藥流組患者引產(chǎn)前絨毛組織中Ang-1、Ang-2和VEGF表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低，引產(chǎn)后明顯升高，絨毛組織中Ang-1、Ang-2和VEGF表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，患者絨毛組織中Ang-1、Ang-2表達(dá)水平和VEGF表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系，初步認(rèn)為VEGF表達(dá)水平下降可抑制絨毛組織血管形成，導(dǎo)致供氧不足，Ang-1、Ang-2表達(dá)水平降低，最終導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞生長(zhǎng)異常，導(dǎo)致稽留流產(chǎn)發(fā)生?；袅鳟a(chǎn)患者服用米非司酮后，Ang-1、Ang-2、VEGF、TNF-α和IL-6水平升高，緩解缺氧，促進(jìn)絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞增生，從而達(dá)到終止稽留流產(chǎn)的目的[20-21]。

本研究只選用了Th1細(xì)胞分泌的TNF-α因子與Th2細(xì)胞分泌的IL-6因子作為指標(biāo)，由于機(jī)體免疫過(guò)程由多細(xì)胞因子參與，因此單一的指標(biāo)不能準(zhǔn)確反映出稽留流產(chǎn)患者治療過(guò)程中總體免疫水平變化，在后續(xù)的研究中應(yīng)增加免疫細(xì)胞因子指標(biāo)，深入探討Th1/Th2細(xì)胞因子與稽留流產(chǎn)的相關(guān)性。