楊軍國,宋振碩,陳 鍵,王麗麗,林清霞,陳 林
(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所,福建 福安 355015)
茶多糖(Tea Polysaccharides,TPs)系茶葉中具有生物學(xué)活性的復(fù)合多糖的簡稱。茶多糖具有多種保健功效,諸如抗氧化、降血糖、降血脂、抗血栓、抗癌、抗輻射、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等[1-3],其抗氧化和降血糖尤為突出。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體系明確證實(shí),茶多糖機(jī)體水平上具有較強(qiáng)的抗氧化活性[4-6]。然而,在以活性氧簇、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)等評價(jià)指標(biāo)的體外抗氧化試驗(yàn),結(jié)果不一。粗茶多糖清除自由基活性強(qiáng)于純茶多糖,純茶多糖片段清除自由基活性低,乃至不具有清除自由基的活性[7-8];同等粗茶葉多糖水平,在不同提取方法、原料、自由基種類等因素作用下茶葉多糖清除自由基活性表達(dá)也不盡相同[9-10]。由此來看,茶多糖提取純化的過程中生物學(xué)活性已經(jīng)發(fā)生了改變,其提取制備過程中的抗氧化活性表達(dá)評價(jià)尤為必要。
近年來,茶多糖在傳統(tǒng)制備方法如酸堿法、熱水浸提法、醇沉法的基礎(chǔ)上,引入超聲波/微波/酶法輔助浸提[11-12]、超臨界流體萃取[13]、膜分離技術(shù)[14]、吸附樹脂技術(shù)[15]、柱色譜法[16-17]等新型提取純化技術(shù),實(shí)現(xiàn)了高效、節(jié)能和環(huán)保。前期本課題組研究表明,采用先65%醇洗+后水提的提取制備方式,可制得≥15%含量的粗茶多糖[18-20]。以該粗茶多糖為原料,經(jīng)膜分離結(jié)合DEAE-纖維素52柱色譜純化分級茶多糖,對其抗氧化活性表達(dá)予以考察評價(jià),以期為茶多糖的純化過程中生物學(xué)活性變化提供參考依據(jù)。
清香烏龍茶系福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所自制;粗茶多糖由大閩食品(漳州)有限公司加工制備(多功能提取罐、95%食用乙醇、碟式分離、反滲透膜濃縮、噴霧干燥塔);福林酚:北京索萊寶科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,純度>97.0%):東京化成工業(yè)株式會社;DEAE-纖維素52:北京索萊寶科技有限公司;羥基自由基試劑盒、超氧陰離子試劑盒、總抗氧化能力試劑盒:南京建成生物工程研究所;鐵氰化鉀:阿拉丁(試劑)上海有限公司;無水乙醇、蒽酮、濃硫酸、葡萄糖等均為分析純試劑:國藥集團(tuán)上海試劑有限公司;其余均為色譜純或分析純試劑。
D99-3型分離層析儀:上海青浦滬西儀器廠;T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì):北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;BONA-GM-19反滲透分離實(shí)驗(yàn)機(jī)(10000D和20000D孔徑膜):濟(jì)南博納生物技術(shù)有限公司;Infinite M多功能微孔板檢測儀(酶標(biāo)儀):瑞士Tecan Group Ltd.;ACD-0502-U實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng):重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司;DK-8D型電熱恒溫水浴槽:上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DHC-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。
1.2.1 粗茶多糖的制備及其膜-纖維素柱色譜分離 以自制清香烏龍茶為原料,每批次10 kg參考楊軍國[20]的方法并結(jié)合傳統(tǒng)速溶茶浸提工藝,采用先65%醇洗+后水提的制備方式,經(jīng)醇洗、水提、碟式分離、反滲透膜濃縮、噴霧干燥,制得水提粗茶多糖。稱取8.50 g該粗茶多糖,溶于1000 mL超純水中,反滲透實(shí)驗(yàn)分離機(jī)于10000D孔徑膜、0.1 MPa壓力下截留分離,截留液再經(jīng)20000 D孔徑膜分離,收集該透過液1000 mL作為分子量為10000~20000的茶多糖溶液。10000~20000 D的茶多糖溶液上DEAE-纖維素52柱色譜(內(nèi)徑1.0 cm×高度40 cm,1 BV約等于12 mL),水洗后,依次用濃度為0.10、0.35和0.60 mol·L-1的NaCl溶液梯度洗脫,分部收集,每部分收集100 mL。以10000~20000 D的1000 mL茶多糖溶液作為對照CK,100 mL各濃度NaCl洗脫多糖液由低到高依次定義為TPs-1、TPs-2和TPs-3,分別檢測其單位體積的理化組分及其抗氧化活性表達(dá)。
1.2.2 DPPH自由基清除率測定 參考韋獻(xiàn)雅[21]的方法,取不同濃度樣品液1.0 mL于試管中,添加無水乙醇至3.0 mL,然后再加入0.1 mmol·L-1的DPPH溶液3.0 mL,總體積為6.0 mL,混勻靜置反應(yīng)30 min,于517 nm波長處比色測定吸光值。其中,對照為相應(yīng)濃度的1.0 mL的NaCl溶液+2.0 mL無水乙醇與3.0 mL的DPPH溶液靜置反應(yīng)后的吸光度數(shù)值。單位體積(mL)DPPH自由基清除率計(jì)算公式為:
式中:A對照為未加樣品的DPPH自由基吸光度;A樣品為加入樣品反應(yīng)后的DPPH自由基吸光度。
1.2.3 還原力檢測 取茶多糖樣品溶液1.0 mL于試管中,依次加入1.0 mL 超純水、2.0 mL的0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1,pH=6.6)和2.0 mL的1%鐵氰化鉀溶液,50℃水浴保溫反應(yīng)20 min,快速冷卻,加入10%的三氯乙酸溶液2.0 mL終止反應(yīng),然后加入0.1 mL的0.1%氯化鐵溶液顯色,混勻靜置反應(yīng)10 min,于700 nm處檢測吸光度值,以相應(yīng)濃度的NaCl溶液作陰性對照。
1.2.4 羥基抑制能力、抗超氧陰離子和總抗氧化能力測定 采用自由基試劑盒檢測,按照自由基測試盒說明書操作。
1.2.5 茶多糖含量的測定 采用蒽酮-硫酸法,以無水葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)對照。吸取蒽酮試劑8.0 mL于25 mL容量瓶中,分別滴入茶多糖溶液1.0 mL,搖勻后沸水加熱3 min,快速冷卻,600 nm處比色測定,以相應(yīng)濃度的NaCl溶液作為陰性對照,依據(jù)葡萄糖線性標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算溶液中的茶多糖含量。
1.2.6 茶多酚含量的檢測 參照國標(biāo)GB/T 8313-2008中的福林酚法檢測不同茶多糖溶液中的茶多酚含量。
采用Origin 7.5和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。試驗(yàn)結(jié)果描述為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”,同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05),大寫字母表示差異極顯著(p<0.01)。
2.1.1 DPPH自由基清除率 DPPH自由基穩(wěn)定,溶于乙醇溶液呈深紫紅色,其褪色程度可反映樣品對DPPH的清除率,因而廣泛應(yīng)用于各種植物提取物的抗氧化活性評價(jià)。本文以自制粗茶多糖為原料,經(jīng)膜分離和DEAE-纖維素52純化制得各級茶多糖CK(10000~20000D區(qū)間茶多糖)、TPs-1、TPs-2和TPs-3,研究考察了其單位體積內(nèi)(mL)的DPPH清除活性變化,結(jié)果見圖1。如圖所示,膜分離制得粗茶多糖CK經(jīng)DEAE-纖維素52分離純化后,DPPH清除活性極顯著降低,不同濃度洗脫制得的分級茶多糖DPPH清除活性亦有所不同,以TPs-2的DPPH清除活性最強(qiáng),低濃度NaCl溶液洗脫制得的TPs-1活性最弱,分級多糖之間呈顯著性差異。綜上所述,茶多糖經(jīng)纖維素柱色譜分級后,DPPH清除活性進(jìn)一步減弱。
圖1 不同茶多糖樣品的DPPH自由基清除活性變化Fig.1 DPPH scavenging activities of tea polysaccharide fractions
2.1.2 抑制羥基自由基能力 茶多糖樣品的抑制羥自由基能力按照試劑盒說明書操作,其每毫升溶液在37℃下反應(yīng)1 min使反應(yīng)體系中H2O2濃度降低1 mmol·L-1為一個(gè)抑制羥自由基能力單位。如圖2所示,不同茶多糖樣品溶液的抑制羥自由基能力變化趨勢與DPPH清除活性變化基本相同,膜分離茶多糖(CK)經(jīng)纖維素柱色譜分級后,抑制羥自由基能力極顯著減弱。纖維素柱色譜分級多糖之間比較來看,低濃度NaCl溶液(0.10 mol·L-1和0.35 mol·L-1)洗脫的茶多糖抑制羥自由基能力變化未見差異顯著性,TPs-2略高,而高濃度NaCl溶液(0.60 mol·L-1)洗脫得到的茶多糖抑制羥自由基能力極顯著降低。
圖2 不同茶多糖樣品的抑制羥基自由基能力Fig.2 Capacity of tea polysaccharide fractions in inhibiting hydroxyl free radicals
2.1.3 抗超氧陰離子活力變化 不同茶多糖樣品溶液的抗超氧陰離子活力變化按照試劑盒說明書操作,在反應(yīng)體系中,每升溶液在37℃下反應(yīng)40 min所抑制的超氧陰離子自由基相當(dāng)于1 mg維生素C所抑制的超氧陰離子自由基的變化值為一個(gè)活力單位。結(jié)果表明,與膜分離制得的粗茶多糖CK相比,纖維素柱色譜分級后茶多糖抗超氧陰離子活力極顯著降低,且由低到高濃度洗脫得到的分級茶多糖抗超氧陰離子活力變化逐漸減弱,分級茶多糖之間呈顯著性差異(圖3)。由此可見,粗茶多糖由膜分離到纖維素柱層析之間,抗超氧陰離子活力變化與清除DPPH和羥基自由基表達(dá)了同樣的趨勢,呈極顯著性減弱。
2.2.1 總抗氧化能力變化 采用試劑盒法考察不同茶多糖樣品的總抗氧化能力變化,37℃時(shí),每分鐘每毫升茶多糖樣品溶液使反應(yīng)體系的吸光度(OD)值每增加0.01時(shí),為一個(gè)總抗氧化能力單位。結(jié)果表明,粗茶多糖經(jīng)10000~20000D膜分離和DEAE-纖維素52柱色譜分離純化后,總抗氧化能力極顯著減弱(圖4)。纖維素柱色譜分離制得的茶多糖樣品TPs-1、TPs-2和TPs-3中,TPs-2總抗氧化能力最強(qiáng),TPs-1次之,TPs-3最弱,呈顯著性降低,與清除自由基活性表達(dá)趨勢基本一致。
圖3 不同茶多糖樣品的抗超氧陰離子活力變化Fig.3 Capacity of tea polysaccharide fractions in inhibiting superoxide anion free radicals
圖4 不同茶多糖樣品的總抗氧化能力表達(dá)Fig.4 Total antioxidative activities of tea polysaccharide fractions
2.2.2 還原力變化 抗氧化劑的還原力變化與其抗氧化活性之間呈正相關(guān)性,采用普魯士藍(lán)法抗氧化劑樣品于700 nm處見最大吸收峰,吸光度數(shù)值的大小變化可反映其還原力的強(qiáng)弱。圖5為分子量10000~20000 D茶多糖(CK)及其相應(yīng)的DEAE-纖維素52柱色譜分級茶多糖TPs-1、TPs-2和TPs-3的還原力吸光度數(shù)值變化,結(jié)果可知,纖維素柱色譜分級茶多糖的吸光度值極顯著性降低,表明還原力極顯著減弱,比較來看,TPs-2還原力最強(qiáng),TPs-1和TPs-3較弱。與總抗氧化能力(試劑盒法)表達(dá)趨勢略有差異,TPs-1和TPs-3之間并未見顯著性差異。
圖5 不同茶多糖樣品的還原力變化Fig.5 Reducing powder of tea polysaccharide fractions
茶多糖樣品的抗氧化活性表達(dá)可歸因于茶多酚、茶多糖等抗氧化活性成分,本文研究分析了不同茶多糖樣品中茶多酚和茶多糖的含量變化,結(jié)果見圖6。結(jié)果表明,從DEAE-纖維素52吸附分離效果來看,以0.35 mol·L-1的NaCl溶液洗脫得到的TPs-2中茶多糖濃度最高,TPs-1次之,TPs-3最低,而TPs-1、TPs-2和TPs-3中茶多酚含量基本未見差異顯著性變化。膜分離多糖CK尚含有較深的色素,可通過DEAE-纖維素實(shí)現(xiàn)脫色。比較發(fā)現(xiàn),膜分離多糖CK及其相應(yīng)纖維素分離多糖TPs-1、TPs-2和TPs-3的茶多糖/茶多酚(濃度值之比)比值分別為4.91、12.34、14.97和8.15,表明茶多糖通過纖維素柱色譜后進(jìn)一步富集。分級茶多糖樣品的抗氧化活性表達(dá)與茶多糖和茶多酚密切相關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果表明(表1),總抗氧化能力與茶多糖和茶多酚呈顯著性正相關(guān),茶多糖的相關(guān)性略高于茶多酚。就清除自由基能力來說,茶多糖和茶多酚與其清除活性變化呈正相關(guān),其中茶多糖與抑制羥基能力呈顯著性正相關(guān)??傮w來看,隨著茶多糖的進(jìn)一步分級純化,茶多糖含量變高,抗氧化活性變?nèi)?,且自由基種類不同清除活性亦有所不同。
圖6 不同茶多糖樣品的成分含量Fig.6 Chemical compositions of tea polysaccharide fractions
表1 茶多糖樣品成分與抗氧化活性表達(dá)的相關(guān)性分析
注:*表示差異顯著(p<0.05)。
氧化應(yīng)激與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),茶多糖的抗氧化活性研究具有重要的生物學(xué)意義。茶多糖的體外清除自由基試驗(yàn),具有不同的作用效果。有研究表明粗茶多糖對羥基和超氧陰離子自由基具有明顯的清除作用,高純度茶多糖則對該類自由基清除能力非常低,幾乎沒有抗氧化能力[7-8]。本文結(jié)果表明,粗茶多糖經(jīng)膜-纖維素柱色譜分級后抗氧化能力極顯著減弱,清除自由基效果變差,這與學(xué)者[7-8]給出的結(jié)論基本一致。前期本課題組研究表明,醇沉分級粗茶多糖的抗氧化活性表達(dá)源于含有的抗氧化組分,呈顯著性正相關(guān)的抗氧化組分為茶多酚,尤其是兒茶素類單體EC和EGCG,茶多糖的抗氧化作用效果弱于茶多酚[22-23]。隨著粗茶多糖的分級純化,茶多酚含量的降低,茶多糖的抗氧化活性表達(dá)與茶多糖含量變化呈顯著性正相關(guān)(表1),茶多糖本身轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡趸钚员磉_(dá)的主要影響因素。
自由基種類是茶多糖抗氧化活性表達(dá)的一個(gè)重要影響因素。苗愛清等[24]也研究比較了超聲波輔助法與傳統(tǒng)常規(guī)法綠茶提取多糖的抗氧化活性變化,結(jié)果表明超聲波輔助法提取的綠茶多糖DPPH自由基清除能力略有提高,ABTS自由基清除活性差異不大,而亞鐵離子絡(luò)合能力降低,分析認(rèn)為超聲波輔助法提取改變了茶葉多糖的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)活性。張麗美等[25]研究發(fā)現(xiàn),超聲波輔助法提取的茶籽多糖對羥基及DPPH自由基具有較高的清除活性,卻幾乎沒有還原能力。李星科[26]等研究表明,與熱水浸提法相比,超聲波輔助提取的信陽紅茶多糖對DPPH自由基和羥基自由基的清除活性明顯降低,而對超氧陰離子自由基清除率差異不大。由此來看,不同加工方法和自由基種類作用下茶多糖的自由基活性表達(dá)也不盡相同。本文研究結(jié)果也表明,纖維素柱色譜分級茶多糖TPs-2、TPs-1和TPs-3對DPPH自由基、羥基和超氧陰離子的清除表達(dá)趨勢也并不相同,DPPH清除率TPs-2>TPs-3>TPs-1,抑制羥基能力TPs-2>TPs-1>TPs-3,抗超氧陰離子活力TPs-1>TPs-2>TPs-3,不同的自由基種類茶多糖展現(xiàn)了不同的作用效果。相關(guān)性分析進(jìn)一步表明,茶多糖與抑制羥基能力呈顯著性正相關(guān),而與DPPH清除率及抗超氧陰離子活力并未有差異相關(guān)性。茶多糖糖鏈龐大,構(gòu)象十分繁雜,其高級結(jié)構(gòu)對生物學(xué)活性的影響最大,不同加工方法可以改變茶多糖的生物學(xué)活性,其結(jié)構(gòu)亦必然發(fā)生了變化。因此,茶多糖的制備-結(jié)構(gòu)-活性的一體系研究應(yīng)作為今后工作開展的進(jìn)一步方向。
綜上所述,粗茶多糖經(jīng)膜分離-纖維素柱色譜法分級后茶多糖進(jìn)一步富集,抗氧化活性顯著性減弱,隨著茶多酚含量的降低,茶多糖含量成為影響其抗氧化活性表達(dá)的主要因素;另外一方面,自由基種類也是影響茶多糖抗氧化活性表達(dá)的重要影響因素,不同自由基種類作用效果不盡相同,自由基種類對茶多糖抗氧化活性表達(dá)的介導(dǎo)行為也應(yīng)成為今后工作的重點(diǎn)。