NCoR和SRC?1在子宮內(nèi)膜重度不典型增生中的表達(dá)及意義

李翠芬 劉燕燕 楊宇峰 霍熾文

東莞市第三人民醫(yī)院婦科（廣東東莞523326）

子宮內(nèi)膜癌是女性常見生殖道惡性腫瘤，約占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的25%［1］，其發(fā)病歷經(jīng)子宮內(nèi)膜增生不伴不典型增生及子宮內(nèi)膜不典型增生及癌變過程，其中子宮內(nèi)膜不典型增生則為子宮內(nèi)膜癌癌前病變常見類型，報道顯示其進(jìn)展為子宮內(nèi)膜癌風(fēng)險高達(dá)23%［2］。至今子宮內(nèi)膜癌仍缺乏敏感性及特異性較高的血清腫瘤標(biāo)志物，探索研究更多的標(biāo)志物對于子宮內(nèi)膜癌及癌前病變的診治有很高的臨床價值［3］?，F(xiàn)國內(nèi)外常用治療子宮內(nèi)膜不典型增生及局部癌變的藥物為孕激素和促性腺激素釋放激素激動劑，研究發(fā)現(xiàn)病變內(nèi)膜對藥物的反應(yīng)率達(dá)57%～94%。孕激素類的作用機(jī)制為減少子宮內(nèi)膜的雌激素核受體水平；抑制子宮內(nèi)膜DNA合成；增加雌二醇向雌酮等活性較弱的雌激素轉(zhuǎn)化。目前認(rèn)為子宮內(nèi)膜癌屬激素依賴性腫瘤，雌激素及抗雌激素水平的變化與子宮內(nèi)膜癌發(fā)病存在密切關(guān)聯(lián)，且子宮內(nèi)膜不典型增生同樣與子宮內(nèi)膜長期持續(xù)受雌激素刺激有關(guān)［4］。施秀等［5］發(fā)現(xiàn)雌激素受體（ER）狀態(tài)與子宮內(nèi)膜病變程度有關(guān)，同時可反映子宮內(nèi)膜細(xì)胞組織對治療的敏感性，是信號傳導(dǎo)通路是子宮內(nèi)膜癌防治的關(guān)鍵靶點(diǎn)。而核受體共調(diào)節(jié)蛋白因子則為與該通路密切相關(guān)的重要元件，其包括共/輔助激活因子（N?CoA）與共/輔助抑制因子（N?CoR），目前認(rèn)為核受體共刺激因子（SRCs）異常表達(dá)可增強(qiáng)ER調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌變。類固醇受體輔活化子?1（SRC?1）則屬于p160家族成員，具備氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶活性，可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子與靶基因結(jié)合，強(qiáng)化雌激素所誘導(dǎo)細(xì)胞增殖能力［6］。但目前國內(nèi)外尚無報道圍繞子宮內(nèi)膜不典型增生患者N?CoR、SRC?1表達(dá)水平的變化展開?；诖?，為探討N?CoR、SRC?1在子宮內(nèi)膜重度不典型增生患者中的表達(dá)及其意義，現(xiàn)對收治的60例子宮內(nèi)膜重度不典型增生患者及30子宮內(nèi)膜正常對象進(jìn)行了研究分析，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1月至2017年2月我院收治的60例子宮內(nèi)膜重度不典型增生患者作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)病理檢查證實(shí)為子宮內(nèi)膜重度不典型增生；強(qiáng)烈要求保留子宮，自愿要求進(jìn)行藥物治療；均為本市常住居民，可完成隨訪調(diào)查；知情且已簽署研究同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重心肝腎肺疾病者；合并自身免疫性疾病者；合并急慢性感染者；合并嚴(yán)重精神障礙者；合并高血壓或糖尿病者；不能配合隨訪者。選擇同期來我院行內(nèi)膜活檢的30例既往無子宮內(nèi)膜病變的正常健康人作為對照組。對照組既往均無子宮內(nèi)膜增厚及病變表現(xiàn)，月經(jīng)規(guī)律，來我院行全身體檢，同意行子宮內(nèi)膜活檢，于月經(jīng)干凈3天來院行宮腔鏡檢查及子宮內(nèi)膜活檢。觀察組年齡31～50歲，平均（43.6±3.1）歲；孕次0～6次，平均（2.6±1.2）次；產(chǎn)次0～4次，平均（1.6± 0.9）次。對照組年齡32～49歲，平均（42.9± 3.5）歲；孕次0～7次，平均（2.4±1.1）次；產(chǎn)次 0～3次，平均（1.7±0.6）次。

1.2 主要試劑與儀器 兔抗人NCoR多克隆抗體（購自Abcam公司）；兔抗人SRC?1多克隆抗體［購自Cell Signaling Technology，Inc（CST）公司］；兔抗人孕激素受體（PR）多克隆抗體、ER多克隆抗體（均購自Abcam公司）；生物素標(biāo)記羊兔二抗、SP免疫組化試劑盒［購自Cell Signaling Technology，Inc（CST）公司］；逆轉(zhuǎn)錄?聚合酶鏈反應(yīng)（RT?PCR）試劑盒、β?actin抗體、Trizol試劑盒（均購自Abcam公司）；NCoR、SRC?1引物（生工生物工程有限公司）。BX?50全自動顯像照相系統(tǒng)、顯微鏡（日本Olympus公司）；電熱恒溫水浴箱（上海醫(yī)療器械七廠）；格蘭仕微波爐（廣東格蘭仕廠）；AS325轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)（英國Shandon公司），TN?100B型托盤式扭力天平（上海第二天平儀器廠）；PCR儀（美國伯樂公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 （1）免疫組化SP法。兩組均行子宮內(nèi)膜活檢，留取子宮內(nèi)膜組織，石蠟包埋，切片機(jī)連續(xù)切片，厚度4～6 μm，切片水浴，晾曬，烘干備用，常規(guī)脫蠟，水化，浸于二甲苯，5 min×3次，切片置入無水乙醇，3 min×2次，梯度酒精脫水（90%、80%、70%），3 min×3次，置于蒸餾水內(nèi)，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗，5 min×3次，TMA上滴加3%H2O2，室溫靜置10 min，PBS沖洗，5 min × 3次，抗原修復(fù)，PBS沖洗5 min×3次，滴入山羊血清封閉液，靜置20 min，去除多余液體，滴入一抗50 μL，室溫靜置60 min，滴加二抗50 μL，室溫靜置60 min，PBS沖洗3次，每次5 min，拭干切片周圍液體，滴入顯色劑DAB，室溫靜置5～10 min，顯微鏡下觀察，顯色完畢蒸餾水沖洗，終止顯色，蘇木精復(fù)染2 min，自來水沖洗，鹽酸酒精分化2 s，自來水沖洗，脫水，透明，中性樹膠封片。每切片均隨機(jī)取5個高倍視野，鏡下觀察細(xì)胞陽性情況，SRC?1、NCoR、ER、PR細(xì)胞陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：采用改良法［7］，觀察各切片染色細(xì)胞比例及強(qiáng)度，染色細(xì)胞比例分5級，分別為0分（染色細(xì)胞＜5%）、1分（染色細(xì)胞占5%～25%）、2分（染色細(xì)胞占25%～30%）、3分（染色細(xì)胞占50%～75%）、4分（染色細(xì)胞超過75%）；染色強(qiáng)度分為4級，分別為0（不著色）、1（淺黃色）、2（棕黃色）、3分（深棕色），染色細(xì)胞計數(shù)計分×染色強(qiáng)度計分為最終結(jié)果，陽性：≥1分（弱陽性：2～3分；中度陽性：4～5分；強(qiáng)陽性：＞5分）；陰性：＜ 1分。（2）RT?PCR法。留取子宮內(nèi)膜組織60 mg置入RNase Free dish內(nèi)，加入預(yù)冷Trizol，快速剪碎組織，成分研磨，加入Trizol，混勻，置入RNase Free EP管，靜置，加氯仿，混勻，靜置5 min后離心，吸上層水相液，加入異丙醇混勻，靜置后離心，加入預(yù)冷75%乙醇，洗滌RNA，沉淀后離心，棄上清，加預(yù)冷無水乙醇，離心，棄上清，提取總RNA，-80℃低溫冰箱保存，逆轉(zhuǎn)錄，EP管內(nèi)加入總RNA 2 μL+Oligo（dt）180.5 μL+ 雙蒸水 3.5 μL，65 ℃孵育5 min，水浴2 min，加入5 ×Buffer 2.0 μL+10 mmol/L dNTPmix 1.0 μL+RNasin 0.5 U/μL，混合均勻后離心，置于PCR儀器內(nèi)42℃反應(yīng)1 h，95℃孵育10 min，70℃反應(yīng)15 min，設(shè)計引物，SRC?1上游引物：5′GTCATTCCTCCTTGAC?CAACTC 3′，下游：5′ATCCCTGTCCGCAGGTATC?TA 3′；NCOR 上游引物：5′ATACTTGCTGGATGGT?GGACT3′，下游：5′TCCTTGCTCTTTTATTTGACG3′；β?actin 上游：5′CCCATCTATGAGGTTACGC3′，下游：5′TTTAATGTCACGCACGATTTC 3′。PCR反應(yīng)體系：5 × buffer 10 μL+ddH2O 28.75 μL+TakaRa TX Taq HS 0.25 μL+ 上下游引物各 0.5 μL+cD?NA 10μL，共50 μL，反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min，94 ℃30 s，57 ℃退火30 s，75 ℃ 1 min，25～35個循環(huán)，72℃延伸5 min，擴(kuò)增結(jié)束加1.5%瓊脂凝膠，紫外燈觀察，凝膠系統(tǒng)照相，采用Gel?Pro Analyzer凝膠分析軟件記錄各條帶光密度，將SRC?1、NCoR基因擴(kuò)增產(chǎn)物與內(nèi)參β?actin條帶積分光密度值比值作為mRNA相對表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 研究數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理，計量資料采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，各指標(biāo)相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜重度不典型增生鏡下特點(diǎn) 子宮內(nèi)膜重度不典型增生鏡下見增生狀態(tài)活躍，見細(xì)胞核不同程度異型性，細(xì)胞核形狀一致，呈圓形或橢圓形，胞質(zhì)嗜酸性紅染或減少，見復(fù)雜腺體結(jié)構(gòu)（圖1A），間質(zhì)減少，腺腔內(nèi)連接，部分見篩孔狀結(jié)構(gòu)或共壁表現(xiàn)（圖1B、C），見密集腺體增生（圖1D），腺上皮指狀突起，形成豐富腔內(nèi)乳頭結(jié)構(gòu)（圖1E、F）。

2.2 兩組子宮內(nèi)膜組織SRC?1、NCoR、ER、PR陽性率比較 觀察組SRC?1陽性率（圖2～3）高于對照組（P＜0.05），其NCoR（圖4～5）、ER、PR表達(dá)陽性率低于對照組，對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

圖1～6 子宮內(nèi)膜重度不典型增生腺體異常結(jié)構(gòu)圖，HE×200Fig.1～6 abnormal structural map of endometrium severe atypical hyperplasia，HE x 200

表1 兩組子宮內(nèi)膜組織SRC?1、NCoR、ER、PR陽性率比較Tab.1 Comparison of the positive rates of SRC?1，NCoR，ER and PR in the endometrium of the two groups 例（%）

2.3 兩組子宮內(nèi)膜組織SRC?1、NCoR mRNA表達(dá)水平比較 觀察組子宮內(nèi)膜組織SRC?1 mRNA水平明顯高于對照組，其NCoR mRNA水平低于對照組，對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.4 子宮內(nèi)膜重度不典型增生內(nèi)膜組織SRC?1、NCoR表達(dá)與ER、PR相關(guān)性分析 子宮內(nèi)膜重度不典型增生患者內(nèi)膜組織SRC?1與ER表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而NCoR與PR表達(dá)水平呈正相關(guān)（P＜0.05），見表3。

圖7 子宮內(nèi)膜重度不典型增生SRC?1表達(dá)（SP×200）Fig.7 SRC?1 expression（SP × 200）of endometrial severe atypical hyperplasia

圖8 正常子宮內(nèi)膜src?1表達(dá)（sp×200）Fig.8 SRC?1 expression in normal endometrium（SP × 200）

圖9 子宮內(nèi)膜重度不典型增生NCoR?1表達(dá)（SP×200）Fig.9 NCoR?1 expression（SP × 200）of endometrial severe atypical hyperplasia

圖10 正常子宮內(nèi)膜NCoR?1表達(dá)（SP×200）Fig.10 NCoR?1 expression in normal endometrium（SP×200）

表2 兩組子宮內(nèi)膜組織SRC?1、NCoR mRNA表達(dá)水平比較Tab.2 Comparison of the expression level of SRC?1 and NCoR mRNA in the endometrium tissue of two groups ±s

表2 兩組子宮內(nèi)膜組織SRC?1、NCoR mRNA表達(dá)水平比較Tab.2 Comparison of the expression level of SRC?1 and NCoR mRNA in the endometrium tissue of two groups ±s

組別觀察組對照組t值P值SRC?1 mRNA 33.45±16.52 7.25±3.54 8.565＜0.001 NCoR mRNA 6.54±4.26 34.84±5.45 27.010＜0.001

表3 子宮內(nèi)膜重度不典型增生內(nèi)膜組織SRC?1、NCoR表達(dá)與ER、PR相關(guān)性分析Tab.3 Correlation Analysis of SRC?1,NCoR expression and ER and PR in endometrial severe atypical endometrium

3 討論

子宮內(nèi)膜癌系女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤，子宮內(nèi)膜重度不典型增生則為癌前病變的主要表現(xiàn)形式，目前認(rèn)為子宮內(nèi)膜不典型增生進(jìn)展為子宮內(nèi)膜癌主要與雌激素持續(xù)刺激子宮內(nèi)膜壁有關(guān)［8］。BARISH 等［9］發(fā)現(xiàn)，無排卵、無孕激素對抗雌激素替代療法、內(nèi)分泌功能性腫瘤等均與子宮內(nèi)膜不典型增生存在密切關(guān)聯(lián)。子宮內(nèi)膜癌作為激素依賴性腫瘤，其對雌激素有其較高的應(yīng)答型，而雌激素及孕激素通過與子宮內(nèi)膜ER、PR受體特異性結(jié)合后將信號傳導(dǎo)其細(xì)胞特定部位，并影響相關(guān)基因調(diào)控及子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞代謝。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜重度不典型增生患者其內(nèi)膜組織ER、PR陽性率較正常子宮內(nèi)膜組織低，提示子宮內(nèi)膜重度不典型增生患者其內(nèi)膜組織雌孕激素受體水平存在一定程度的改變，主要與子宮內(nèi)膜組織ER、PR表達(dá)異常可能引起局部雌激素代謝紊亂，影響雌激素作用，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜不典型增生有關(guān)。但雌激素活性受到多個受體亞型調(diào)節(jié)，因此無法單純通過ER水平的變化來判斷子宮內(nèi)膜不典型增生表現(xiàn)［10］。近年來發(fā)現(xiàn)，類固醇受體輔活化子家族可調(diào)節(jié)ER、PR活性，影響細(xì)胞增殖［11］。

SRC系類固醇受體輔活化子家族成員，其分子C端受體作用區(qū)同存在不同LXXLL系列，其以配體依賴形式與核受體相互作用，并通過甲基化、乙?；容o助因子提高核受體基因轉(zhuǎn)錄活性，對ER、PR、糖皮質(zhì)激素受體、甲狀腺素受體等發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)效應(yīng)，影響生長、發(fā)育其增殖［12］。其中SRC?1則為SRC家族中最早被克隆的基因類型，在正常組織中可見表達(dá)，同時在部分腫瘤患者中可見SRC?1異常表達(dá)。王麗紅等［13］發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者機(jī)體SRC?1存在明顯過度表達(dá)現(xiàn)象，對雌激素所誘導(dǎo)細(xì)胞增殖有明顯的強(qiáng)化效應(yīng)。SRC?1具有組氨酸乙酰化轉(zhuǎn)移酶的活性，能夠改變轉(zhuǎn)錄因子與靶基因的結(jié)合力，影響基因的轉(zhuǎn)錄。REINERI等［14］等報道稱在乳腺癌細(xì)胞中ER/SRC?1復(fù)合物的存在增強(qiáng)了雌激素誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖能力。所以類固醇受體輔助活化因子在調(diào)節(jié)ER功能上發(fā)揮了重要作用。NCoR為核受體輔阻遏子超家族成員，是非配體化核受體主要結(jié)合蛋白，與SRC相反，其具備去乙?；D(zhuǎn)移酶活性，可與核受體結(jié)合蛋白作用發(fā)揮疏水裂隙作用，抑制其轉(zhuǎn)錄活性。且NCoR其雌激素受體作用位點(diǎn)與SRC?1相同，因此形成輔活化子?輔阻遏子開關(guān)，兩者共同競爭與該位點(diǎn)結(jié)合，共同調(diào)節(jié)雌激素轉(zhuǎn)錄活性。NCoR分子的C端含有RID受體作，丁巍等［15］發(fā)現(xiàn)，NCoR在孕酮存在的情況下可以與PR形成復(fù)合物，招募PR反應(yīng)元件，從而抑制黃體酮靶基因的轉(zhuǎn)錄。且該研究表示，乳腺癌患者NCoR表達(dá)水平上調(diào)可抑制ER所誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜重度異常增生患者其子宮內(nèi)膜組織SRC?1表達(dá)水平低于對照組，且其NCoR表達(dá)水平高于對照組，提示子宮內(nèi)膜重度不典型增生患者其子宮內(nèi)膜組織存在高水平表達(dá)，而低水平ER與SRC?1結(jié)合可能強(qiáng)化核受體活性，提高子宮內(nèi)膜對雌激素的敏感性，促進(jìn)子宮內(nèi)膜異常增生。同時其NCoR表達(dá)水平較低，主要可能與子宮內(nèi)膜重度不典型增生患者其內(nèi)膜組織PR水平較低有關(guān)，可進(jìn)一步下調(diào)NCoR水平，強(qiáng)化核受體活性，促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，SRC?1與ER表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而NCoR與PR表達(dá)呈正相關(guān)，主要可能與低水平ER可激活SCR?1表達(dá)，而低水平PR可誘導(dǎo)NCoR表達(dá)水平降低有關(guān)，且高水平SRC?1與低水平NCoR均可介導(dǎo)雌激素調(diào)節(jié)，影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞生長及增殖，促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞呈浸潤性生長，增加癌變風(fēng)險，本研究創(chuàng)新點(diǎn)為探討SRC?1和NCoR在子宮內(nèi)膜重度不典型增生患者中的表達(dá)情況，為子宮內(nèi)膜重度不典型增生的預(yù)后提供一個新的參考指標(biāo)，并為子宮內(nèi)膜重度不典型增生激素治療提供更為有力的輔助判斷指標(biāo)。