丹參素對(duì)腹膜粘連組織成纖維細(xì)胞膠原合成與降解的調(diào)控

曾煦欣 陳應(yīng)軍 毛建文 王芳 李艷萍 蔣泓 張麗華

1佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院（廣東佛山 528000）；2佛山市第一人民醫(yī)院（廣東佛山 528000）；3廣東藥科大學(xué)（廣州 510006）

手術(shù)后腹膜粘連（術(shù)后粘連）是腹盆腔手術(shù)常見并發(fā)癥，發(fā)生率達(dá)90%以上，常導(dǎo)致腸梗阻、慢性腹痛、婦女不孕等后遺癥發(fā)生［1-2］。術(shù)后粘連主要成因是組織受損處沉積的纖維蛋白未能及時(shí)被體內(nèi)清除，成纖維細(xì)胞長入后過量分泌膠原等細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致纖維蛋白最終機(jī)化形成臟器間、臟器與腹膜間的永久性粘連。中藥丹參（Salvia miltiorrhizaBge.）具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)的功效，近年被廣泛用于術(shù)后粘連防治，效果良好［3］。本課題組前期對(duì)丹參防治術(shù)后粘連的藥效基礎(chǔ)與作用機(jī)制進(jìn)行初步研究，從人體與大鼠腹膜粘連組織中分離培養(yǎng)出成纖維細(xì)胞（adhesion tissue fibro?blasts，ATF），發(fā)現(xiàn)丹參可抑制ATF增殖與膠原合成［4］，其水溶性成分丹參素（Danshensu，DSS）通過下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF?β1）mRNA水平抑制ATF增殖［5］。本研究使用TGF?β1刺激ATF模擬術(shù)后粘連的病理微環(huán)境，通過檢測與膠原合成與降解相關(guān)的Ⅰ型膠原蛋白（COL?Ⅰ）、基質(zhì)金屬蛋白?1（MMP?1）與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑?1（TIMP?1）表達(dá)水平，考察DSS對(duì)ATF細(xì)胞外基質(zhì)的影響，以進(jìn)一步探討其分子藥理學(xué)機(jī)制，為傳統(tǒng)中藥丹參在術(shù)后粘連防治領(lǐng)域中的應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 丹參素鈉對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院），DMEM高糖培養(yǎng)基（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），胎牛血清（Hyclone公司），0.25%胰酶（GIBCO公司），磷酸鹽緩沖液（武漢博士德生物工程有限公司），Human TGF?β1（Invitrogen公司），CKK?8試劑盒（日本東仁化學(xué)），RNAprep試劑盒（TIANGEN公司），RT試劑盒（TAKARA公司），SYBR?Premix Ex TaqTM（TAKARA公司），Human COL?Ⅰ、MMP?1、TIMP?1 ELISA 試劑盒（CUSABIO BIOTECH公司）。

1.2 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿與培養(yǎng)瓶（Cornig?Costar公司），HHB11500型電熱恒溫箱（廣州醫(yī)療設(shè)備廠），DS?Ⅱ型電熱三用水浴箱（北京市醫(yī)療設(shè)備廠），MCO?15AC型CO2培養(yǎng)箱（SANYO公司），SW?LG?1F超凈臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司），CKX?41型倒置顯微鏡（OLYMPUS公司），KDC?220HR高速冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司），MiniOpticon型Real time PCR儀（BIO?RAD公司），ELx808酶標(biāo)儀（BioTek公司），8道手動(dòng)調(diào)節(jié)移液器（BIOHIT公司）。

1.3 方法

1.3.1 ATF的體外培養(yǎng) 取人體粘連組織，按照文獻(xiàn)［6］方法進(jìn)行ATF的原代培養(yǎng)，取第3～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)條件：原代培養(yǎng)使用含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，傳代后胎牛血清含量改為10%，溫度37℃，CO2濃度5%，相對(duì)濕度95%。

1.3.2 CCK?8細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn) 收集生長狀態(tài)良好的ATF，經(jīng)0.25%胰酶消化，以每孔5×103個(gè)的密度接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，換成無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)8 h，加入不同濃度TGF?β1（0、0.5、1、2.5、5、10、20、40、80 ng/mL），每個(gè)劑量組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，移去原培養(yǎng)液后加入含10%CCK?8溶液100 μL，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度值（OD值）。根據(jù)結(jié)果計(jì)算各組的細(xì)胞活性。細(xì)胞活性（viability）=用藥組（OD值）/實(shí)驗(yàn)組（OD值）×100%。

按上述同樣的方法接種ATF于96孔板，無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)8 h后，加入10 ng/mL TGF?β1刺激6 h后，再加入不同濃度DSS（0、2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L），每個(gè)劑量組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，按同法測定各組的細(xì)胞活性。

1.3.3 Real?time PCR實(shí)驗(yàn) 將ATF接種于直徑6 cm培養(yǎng)皿，每皿細(xì)胞數(shù)1×106個(gè)，經(jīng)貼壁、同步化處理后，分為空白組、模型組與DSS 2.5、10、40 μmol/L組。除空白組外，各組均按10 ng/mL劑量加入 TGF?β1，培養(yǎng) 6 h，DSS各組按2.5、10、40 μmol/L劑量加入丹參素鈉，空白組與模型組加入等體積PBS，培養(yǎng)48 h。按試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置-20℃下凍存待用。根據(jù)NCBI提供的人體mRNA序列，用Prime Premier軟件設(shè)計(jì)內(nèi)參β?actin與目的基因COL?Ⅰ、MMP?1、TIMP?1的引物（表1），由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。按照SYBR?Premix Ex TaqTM中的25 μL體系進(jìn)行Real time PCR檢測，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火/延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。記錄 CT值，采用2-ΔΔCT法計(jì)算各藥物組相對(duì)于空白對(duì)照組的 MMP?1、TIMP?1 mRNA表達(dá)倍數(shù)F。F=2-［（待測目的基因平均CT值-待測內(nèi)參平均CT值）-（對(duì)照目的基因平均CT值-對(duì)照內(nèi)參平均CT值）］。

1.3.4 ELISA實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，按ELISA試劑盒上的說明書進(jìn)行操作，檢測上清液中COL?Ⅰ、MMP?1、TIMP?1的蛋白水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性分析，各組間的差異采用單因素方差分析（One?way ANOVA），若方差齊性，組間差異比較采用LSD檢驗(yàn)（Least?significant Differ?ence），方差不齊則采用Dunnett′s T3檢驗(yàn)。

表1 Real?time PCR檢測用引物序列Tab.1 Primers of Real?time PCR

2 結(jié)果

2.1 TGF?β1與DSS對(duì)ATF細(xì)胞活性的影響 不同劑量TGF?β1下的細(xì)胞活性如圖1A所示，當(dāng)濃度在5～10 ng/mL時(shí)細(xì)胞活性最高。在TGF?β1刺激下，DSS各劑量組的細(xì)胞活性如圖2B所示，DSS 2.5、5、10、20、40 μmol/L 組與0 μmol/L 組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），DSS 80、160 μmol/L組的細(xì)胞活性低于0 μmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。

圖1 TGF?β1與DSS對(duì)細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effects of TGF?β1 and Danshensu on fibroblast viability

2.2 DSS對(duì)ATF COL?Ⅰ、MMP?1、TIMP?1 mRNA表達(dá)的影響 各組ATF的COL?Ⅰ、MMP?1、TIMP?1 mRNA水平如圖2A所示。One?way ANOVA結(jié)果顯示，各組的COL?Ⅰ、TIMP?1 mRNA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），MMP?1 mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。LSD檢驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組、DSS 2.5 μmol/L 組的 COL?Ⅰ、TIMP?1 mRNA水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），模型組與DSS 40 μmol/L組MMP?1 mRNA水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，DSS 2.5、10、40 μmol/L組的COL?Ⅰ mRNA水平下調(diào)，DSS 10、40 μmol/L組的TIMP?1 mRNA水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。

2.3 DSS對(duì)ATF COL?Ⅰ、MMP?1、TIMP?1 蛋白表達(dá)的影響 各組ATF的COL?Ⅰ、MMP?1、TIMP?1蛋白水平如圖2B～2D所示。One?way ANOVA結(jié)果顯示，各組ATF的COL?Ⅰ、MMP?1、TIMP?1蛋白水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。LSD檢驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組的COL?Ⅰ、TIMP?1水平升高，MMP?1水平下降，DSS 2.5 μmol/L的COL?Ⅰ水平升高，DSS 2.5、10、40 μmol/L組的MMP?1水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比，DSS 10、40 μmol/L組COL?Ⅰ水平下降，DSS 2.5、10、40 μmol/L組TIMP?1水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）；DSS 2.5、10、40 μmol/L組MMP?1水平升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

術(shù)后粘連的產(chǎn)生與各種細(xì)胞、細(xì)胞因子、趨化因子、缺氧、缺血等腹腔微環(huán)境的改變密切相關(guān)［6］。文獻(xiàn)顯示，遷移到腹膜損傷處的成纖維細(xì)胞在TGF?β的誘導(dǎo)下發(fā)生過度增殖，同時(shí)引起膠原等細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度沉積，最終形成不可逆的粘連［7］，TGF?β在腹腔液中的過度表達(dá)可導(dǎo)致粘連發(fā)生率提高［8］?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一類依賴于Zn2+的內(nèi)肽酶，具有降解各種ECM成分的活性，其活性可被組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue me?talloproteinase inhibitors，TIMPs）抑制。兩者在細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、ECM沉積與降解中起重要調(diào)節(jié)作用。DIAMOND等［9］認(rèn)為MMP?1水平升高與TIMP?1水平降低能促進(jìn)ECM降解，從而減少粘連發(fā)生，若MMP?1水平抑制與TIMP?1水平升高則ECM沉積，導(dǎo)致粘連增加。本研究據(jù)此選取ECM代表性成分COL?Ⅰ以及與其沉積與降解相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白MMP?1與TIMP?1為檢測指標(biāo)，考察DSS對(duì)處于病理微環(huán)境下的ATF膠原合成與降解的影響。

本課題組在前期研究中將TGF?β1與人體ATF共培養(yǎng)，結(jié)果顯示TGF?β1在一定劑量范圍內(nèi)可明顯提高ATF的增殖活性與COL?Ⅰ合成水平［10］。本研究結(jié)果顯示TGF?β1劑量在5～20 ng/mL時(shí)能提高ATF細(xì)胞活性，10 ng/mL TGF?β1可上調(diào)ATFCOL?Ⅰ、TIMP?1 mRNA 與蛋白水平，下調(diào) MMP?1 mRNA與蛋白水平，表明該刺激劑量可模擬術(shù)后粘連形成的病理微環(huán)境，為本研究建立了體外模型。

圖2 各組COL?Ⅰ、MMP?1與TIMP?1的mRNA與蛋白表達(dá)Fig.2 COL?Ⅰ，MMP?1，TIMP?1 mRNA and protein expression in different groups

CCK?8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DSS在2.5～ 40 μmol/L范圍內(nèi)不影響ATF細(xì)胞活性，據(jù)此選擇2.5、10、40 μmol/L作為實(shí)驗(yàn)劑量，以保證在同一細(xì)胞數(shù)量水平上考察DSS對(duì)ATF的影響。Real?time PCR與ELISA結(jié)果顯示DSS各劑量組COL?Ⅰ、TIMP?1 mRNA與蛋白表達(dá)水平低于模型組，同時(shí)DSS 10、40 μmol/L劑量組的COL?Ⅰ、TIMP?1表達(dá)水平與空白組無差異，提示DSS通過下調(diào)COL?Ⅰ表達(dá)抑制ATF膠原合成，下調(diào)TIMP?1表達(dá)促進(jìn)ATF膠原降解，并將其COL?Ⅰ與TIMP?1恢復(fù)至無TGF?β1刺激的正常水平。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)丹參另一個(gè)水溶性成分丹酚酸B對(duì)ATF也有類似作用：下調(diào)COL?Ⅰ、Fibronectin表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)MMP?9表達(dá)、降低TIMP?1活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解平衡［11］。丹酚酸B由3分子DSS與1分子咖啡酸縮合而成，結(jié)合本研究結(jié)果分析，丹酚酸B可能通過其水解產(chǎn)物DSS發(fā)揮對(duì)ATF膠原合成與降解的調(diào)控作用。

VERRECCHIA 等［12］發(fā)現(xiàn) COL?Ⅰ、COL?Ⅲ、COL?Ⅴ等基因的表達(dá)受TGF?β/Smad3通路調(diào)控。近年的研究顯示，DSS可干擾TGF?β/Smad3信號(hào)通路，抑制缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖［13］；通過下調(diào)肝星形細(xì)胞TβRⅠ、TβRⅡ蛋白的表達(dá)，抑制其活化增殖，同時(shí)上調(diào)Smad7 mRNA表達(dá)，下調(diào)Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)，抑制TGF?β誘導(dǎo)的肝星形細(xì)胞活化［14］；DSS還能減弱高糖刺激下腹膜間皮細(xì)胞COL?Ⅰ與fibronectin的蛋白與mRNA表達(dá)［15］。根據(jù)上述文獻(xiàn)以及本研究結(jié)果，筆者推測DSS通過調(diào)控ATF TGF?β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低ATF細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，從而減少粘連產(chǎn)生。今后我們將繼續(xù)考察DSS、丹酚酸B等丹參主要化學(xué)成分對(duì)TGF?β信號(hào)通路的影響，為闡明丹參防治術(shù)后粘連的分子藥理學(xué)機(jī)制提供更多理論依據(jù)。