miR-548c表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移中的作用

孫小淳，李析蒨，趙 坤，張愛臣*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 婦產(chǎn)科，吉林 長春130033;2.琿春市人民醫(yī)院)

侵襲性生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是腫瘤惡性化進(jìn)程的主要特征，涉及到一系列基因表達(dá)改變以及信號(hào)通路的影響[1,2]。研究表明，miRNA在惡性腫瘤中的表達(dá)水平高低與其具有促癌或抑癌作用有關(guān)[3,4]。miR-548c屬于miRNA家族成員，在之前的研究中我們已發(fā)現(xiàn)miR-548c在子宮內(nèi)膜癌以及卵巢癌組織中的表達(dá)水平異常下調(diào)，且miR-548c表達(dá)下調(diào)與子宮內(nèi)膜癌患者的不良預(yù)后有關(guān)，miR-548c在子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展中可能具有抑癌基因的作用。為了明確miR-548c在子宮內(nèi)膜癌以及卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機(jī)制，本研究通過分別上調(diào)和下調(diào)miR-548c在子宮內(nèi)膜癌以及卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)，檢測(cè)miR-548c表達(dá)變化后對(duì)上述細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，旨在為了解miR-548c對(duì)子宮內(nèi)膜癌以及卵巢癌惡性化生長的影響，從而為探索miR-548c在子宮內(nèi)膜癌以及卵巢癌發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系

本研究所采用的人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系(RL95-2和HEC-1)和人卵巢癌細(xì)胞系(SKOV-3和OVCAR3)均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心上海細(xì)胞庫，對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系和卵巢癌細(xì)胞系的細(xì)胞行細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞傳代和細(xì)胞凍存。

1.2miR-548cmimic和miR-548cinhibitor抑制劑

miR-548c mimic(40 nM)、miR-548c inhibitor(40 nM)及其相應(yīng)陰性對(duì)照均購自美國Ambion公司。Bulge-Loop miRNA qRT-PCR檢測(cè)試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司，胎牛血清(FBS)購自Hyclone公司，Trizol總RNA提取試劑盒DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自Gibco公司。

1.3子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌細(xì)胞系中miR-548c表達(dá)檢測(cè)

采用熒光定量PCR分別檢測(cè)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系(RL95-2和HEC-1)和人卵巢癌細(xì)胞系(SKOV-3和OVCAR3)中miR-548c的表達(dá)。

1.4實(shí)驗(yàn)分組

RL95-2細(xì)胞，Anti-Ctr組：將miRNA inhibitor control轉(zhuǎn)染RL95-2細(xì)胞；Anti-548c組：將miR-548c inhibitor轉(zhuǎn)染RL95-2細(xì)胞。OVCAR3細(xì)胞，Anti-Ctr組：將miRNA inhibitor control轉(zhuǎn)染OVCAR3細(xì)胞；Anti-548c組：將miR-548c inhibitor轉(zhuǎn)染OVCAR3細(xì)胞。HEC-1細(xì)胞，Pre-Ctr：將miRNA mimic control轉(zhuǎn)染HEC-1細(xì)胞；Pre-548c：將miR-548c mimic轉(zhuǎn)染HEC-1細(xì)胞。SKOV-3細(xì)胞，Pre-Ctr：將miRNA mimic control轉(zhuǎn)染SKOV-3細(xì)胞；Pre-548c：將miR-548c mimic轉(zhuǎn)染SKOV-3細(xì)胞。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞的培養(yǎng)液棄盡，向瓶內(nèi)加入無抗生素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，隨后繼續(xù)培養(yǎng)24 h；用移液器吸取50 μl無血清無抗生素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，分別吸取20 pmol miR-548c mimic/miR-548c inhibitor質(zhì)粒及其陰性對(duì)照miRNA mimic control/miRNA inhibitor control質(zhì)粒加入到培養(yǎng)基內(nèi)；向一支新的無菌離心管內(nèi)加入50 μl無FBS無抗生素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，將1 μl 2 000加入至上述離心管內(nèi)，用微量移液器輕柔混勻，于超凈工作臺(tái)中靜置5 min；隨后用微量移液器將兩者輕柔混勻，于超凈工作臺(tái)上靜置20 min；倒掉細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)原有的培養(yǎng)基，分別將無抗生素和FBS的DMEM培養(yǎng)基加入至各細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，將獲得的轉(zhuǎn)染試劑分別加入至相應(yīng)的細(xì)胞孔中，將細(xì)胞版放置于培養(yǎng)箱中4-6 h，然后倒掉瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，更換為含有10% FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，采用熒光定量PCR分別檢測(cè)上述各組細(xì)胞中miR-548c的表達(dá)。

1.6細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)

無基質(zhì)膠Transwell的制備：①包被基質(zhì)膜，1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜，隨后將之放置在4℃環(huán)境下風(fēng)干；②水化基底膜，用移液器將細(xì)胞培養(yǎng)板中殘留的液體吸出，向每孔細(xì)胞內(nèi)加入50 μl含有10 g/L 的DMEM無血清培養(yǎng)基，隨后將該培養(yǎng)板放置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)30 min；取1體積預(yù)冷的Transwell膠和8體積無血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，將兩者徹底混勻，把混合后的溶液分別加入Transwell小室底部膜內(nèi)(50 μL/孔)，隨后將Transwell小室放置在培養(yǎng)箱中直至成膠；棄掉細(xì)胞培養(yǎng)上清，將培養(yǎng)液更換為無血清DMEM培養(yǎng)基，隨后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞12-24 h，采用胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS清洗1-2次，最后一次離心后將上清棄盡，向管內(nèi)加入DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，分別吸取200 μl上述調(diào)整好密度的細(xì)胞懸液至于每個(gè)Transwell小室的上室中，再分別吸取含有10% FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液于每個(gè)Transwell小室的下室中；將制好的Transwell小室板繼續(xù)培養(yǎng)48 h，隨后將Transwell小室板中的原有培養(yǎng)液棄掉，并用PBS對(duì)板內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行清洗，再對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定；然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色；將染色畢后的Transwell小室板置于顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，對(duì)每組細(xì)胞設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，并重復(fù)本實(shí)驗(yàn)3次，求細(xì)胞數(shù)的平均值。

1.7細(xì)胞遷移能力檢測(cè)

按照分組要求將相應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，隨后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄掉瓶內(nèi)原有培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液清洗細(xì)胞2-3次，隨后用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并制成單細(xì)胞懸液；向Transwell(8 μm孔徑)下室內(nèi)加入600 μl含有10% FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，在上室內(nèi)加入200 μl前一步驟獲得的細(xì)胞懸液，放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h；將上室和下室中的液體棄掉，隨后向下室內(nèi)加入600 μl 4%多聚甲醛固定細(xì)胞，時(shí)間為30 min，將多聚甲醛棄掉，用棉簽擦除未穿過膜的細(xì)胞；向下室內(nèi)加入600 μl 0.1%結(jié)晶紫溶液進(jìn)行染色，時(shí)間為10 min，用PBS緩沖液清洗Transwell小室，在顯微鏡下觀察細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌細(xì)胞系中miR-548c表達(dá)檢測(cè)

采用熒光定量PCR分別檢測(cè)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系(RL95-2和HEC-1)和人卵巢癌細(xì)胞系(SKOV-3和OVCAR3)中miR-548c的表達(dá)。結(jié)果顯示(圖1)，在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中，RL95-2細(xì)胞miR-548c的表達(dá)水平明顯高于HEC-1細(xì)胞；在卵巢癌細(xì)胞系中，OVCAR3細(xì)胞miR-548c的表達(dá)水平明顯高于SKOV-3細(xì)胞。

2.2轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中miR-548c表達(dá)檢測(cè)

采用熒光定量PCR分別對(duì)轉(zhuǎn)染后人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系(RL95-2和HEC-1)和人卵巢癌細(xì)胞系(SKOV-3和OVCAR3)中miR-548c的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示(圖2)，在RL95-2細(xì)胞中，與Anti-Ctr組相比，Anti-548c組細(xì)胞中miR-548c的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；在OVCAR3細(xì)胞中，與Anti-Ctr組相比，Anti-548c組細(xì)胞中miR-548c的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；在HEC-1細(xì)胞中，與Pre-Ctr組相比，Pre-548c組細(xì)胞中miR-548c的表達(dá)水平明顯增高(P<0.01)；在SKOV-3細(xì)胞中，與Pre-Ctr組相比，Pre-548c組細(xì)胞中miR-548c的表達(dá)水平明顯增高(P<0.01)。上述研究結(jié)果表明，miR-548c表達(dá)抑制的RL95-2和OVCAR3細(xì)胞系，以及miR-548c表達(dá)上調(diào)的HEC-1和SKOV-3細(xì)胞系構(gòu)建成功，可用于下一步實(shí)驗(yàn)研究。

2.3細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)

采用Transwell法分別對(duì)轉(zhuǎn)染后人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系(RL95-2和HEC-1)和人卵巢癌細(xì)胞系(SKOV-3和OVCAR3)的侵襲能力進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示(圖3)，在RL95-2細(xì)胞中，與Anti-Ctr組相比，Anti-548c組細(xì)胞侵襲能力明顯升高(P<0.01)；在OVCAR3細(xì)胞中，與Anti-Ctr組相比，Anti-548c組細(xì)胞侵襲能力顯著上升(P<0.01)；在HEC-1細(xì)胞中，與Pre-Ctr組相比，Pre-548c組細(xì)胞侵襲能力明顯下降(P<0.01)；在SKOV-3細(xì)胞中，與Pre-Ctr組相比，Pre-548c組細(xì)胞侵襲能力明顯降低(P<0.01)。

2.4細(xì)胞遷移能力檢測(cè)

采用Transwell法分別對(duì)轉(zhuǎn)染后人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系(RL95-2和HEC-1)和人卵巢癌細(xì)胞系(SKOV-3和OVCAR3)的遷移能力進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示(圖4)，在RL95-2細(xì)胞中，與Anti-Ctr組相比，Anti-548c組細(xì)胞遷移能力明顯升高(P<0.01)；在OVCAR3細(xì)胞中，與Anti-Ctr組相比，Anti-548c組細(xì)胞遷移襲能力顯著上升(P<0.01)；在HEC-1細(xì)胞中，與Pre-Ctr組相比，Pre-548c組細(xì)胞遷移能力明顯下降(P<0.01)；在SKOV-3細(xì)胞中，與Pre-Ctr組相比，Pre-548c組細(xì)胞遷移能力明顯降低(P<0.01)。

**P<0.01 vs Anti-Ctr/Pre-Ctr

**P<0.01 vs Anti-Ctr/Pre-Ctr

3 討論

機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞受到了原癌基因發(fā)生活化或者抑癌基因出現(xiàn)異常失活的影響，從而使得細(xì)胞的增殖生長及分化發(fā)生失控，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)向癌細(xì)胞發(fā)展。在惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展的一系列過程當(dāng)中，惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是其最為致命的環(huán)節(jié)[5,6]。子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展為一個(gè)多因素共同參與的多階段級(jí)聯(lián)反應(yīng)的復(fù)雜過程，依賴于子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌細(xì)胞以及促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌細(xì)胞生長、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管新生等一系列內(nèi)環(huán)境因素的相互作用。在多種惡性腫瘤組織以及細(xì)胞系中均能檢測(cè)到miRNA的異常表達(dá)，所以miRNA在腫瘤的惡性化進(jìn)程中扮演著至關(guān)重要的角色。miRNA能夠經(jīng)由調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲以及轉(zhuǎn)移等影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，最終發(fā)揮著類似癌基因或者抑癌基因的作用。隨著基因測(cè)序和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究證明miRNA在生殖系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、惡性化進(jìn)展以及耐藥等過程中發(fā)揮著重要作用[7-9]。

**P<0.01 vs Anti-Ctr/Pre-Ctr

miRNA的表達(dá)發(fā)生異常改變往往預(yù)示著疾病的發(fā)生和發(fā)展，因此采用人為手段把與疾病進(jìn)程相關(guān)的miRNA表達(dá)水平上調(diào)或者下調(diào)，或者將對(duì)于疾病的研究以及相關(guān)藥物的研制開發(fā)具有十分重要的意義，該領(lǐng)域也是目前腫瘤醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。近幾年來研究者們已經(jīng)相繼發(fā)現(xiàn)了多種能夠有效調(diào)控miRNA表達(dá)的方法，其中包括模擬物、抑制劑、轉(zhuǎn)基因?qū)W以及點(diǎn)突變等。而在上述各種途徑當(dāng)中，通過轉(zhuǎn)染模擬物或者加入抑制劑的方法影響目標(biāo)miRNA的表達(dá)最為有效，且操作更為簡單易行，成功率高，所以已經(jīng)成為現(xiàn)階段疾病和藥物研究領(lǐng)域中應(yīng)用較為廣泛的實(shí)驗(yàn)方法[10-12]。在之前的研究中我們發(fā)現(xiàn)，miR-548c在子宮內(nèi)膜癌以及卵巢癌組織中的表達(dá)水平異常下調(diào)，且miR-548c表達(dá)下調(diào)與子宮內(nèi)膜癌患者的不良預(yù)后有關(guān)。上述研究結(jié)果提示，miR-548c在子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展中可能具有抑癌基因的作用。為了了解miR-548c在子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌惡性化進(jìn)程中的具體作用，本研究通過轉(zhuǎn)染miR-548c模擬物或抑制劑的方法上調(diào)或下調(diào)子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌細(xì)胞系中miR-548c的表達(dá)水平，旨在明確miR-548c表達(dá)變化后對(duì)上述兩種類型細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。為了更好的開展后續(xù)研究，我們首先對(duì)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌細(xì)胞系進(jìn)行選擇。結(jié)果顯示，在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中，RL95-2細(xì)胞miR-548c的表達(dá)水平明顯高于HEC-1細(xì)胞；在卵巢癌細(xì)胞系中，OVCAR3細(xì)胞miR-548c的表達(dá)水平明顯高于SKOV-3細(xì)胞。因此，本研究選取上述細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別將miR-548c mimic(40 nM)、miR-548c inhibitor(40 nM)及其相應(yīng)陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染篩選出的子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌細(xì)胞系，隨后用熒光定量PCR測(cè)定轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中miR-548c的表達(dá)情況，用以鑒定轉(zhuǎn)染是否成功。結(jié)果顯示，在RL95-2細(xì)胞中，與Anti-Ctr組相比，Anti-548c組細(xì)胞中miR-548c的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；在OVCAR3細(xì)胞中，與Anti-Ctr組相比，Anti-548c組細(xì)胞中miR-548c的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；在HEC-1細(xì)胞中，與Pre-Ctr組相比，Pre-548c組細(xì)胞中miR-548c的表達(dá)水平明顯增高(P<0.01)；在SKOV-3細(xì)胞中，與Pre-Ctr組相比，Pre-548c組細(xì)胞中miR-548c的表達(dá)水平明顯增高(P<0.01)。上述研究結(jié)果表明，miR-548c表達(dá)抑制的RL95-2和OVCAR3細(xì)胞系，以及miR-548c表達(dá)上調(diào)的HEC-1和SKOV-3細(xì)胞系構(gòu)建成功，可用于下一步實(shí)驗(yàn)研究。

腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是造成患者預(yù)后不良和復(fù)發(fā)、死亡率上升的主要原因。miR-548c對(duì)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移具有抑制作用，那么其是否對(duì)子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌的侵襲和遷移也能夠發(fā)揮相同的功能？本研究采用Transwell小室法分別檢測(cè)了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。結(jié)果表明，在RL95-2和OVCAR3細(xì)胞中，miR-548c表達(dá)抑制后細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯增高(P<0.01)；而在SKOV-3和HEC-1細(xì)胞中，當(dāng)miR-548c表達(dá)上調(diào)后細(xì)胞的侵襲和遷移能力則顯著降低(P<0.01)。上述研究結(jié)果表明，miR-548c對(duì)子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移具有抑制作用。

綜上所述，本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)miR-548c對(duì)子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌細(xì)胞的侵襲、遷移具有抑制作用，從而抑制子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌發(fā)生和發(fā)展。但上述過程中的相關(guān)機(jī)制尚未探明，因此還需進(jìn)一步探索研究。