美洲大蠊成蟲腸道菌群多樣性分析

郝艷芹， 周闖， 晉家正， 沈詠梅， 張修月， 岳碧松*

(1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都610065；2.藥用美洲大蠊四川省重點實驗室，成都610081)

宿主腸道中微生物群落與其健康相關(guān)，它們能夠與宿主相互協(xié)作增加機(jī)體整體適應(yīng)性(張振宇等，2017)。腸道菌群能合成膽汁酸、膽堿以及短鏈脂肪酸等對機(jī)體健康有利的代謝產(chǎn)物(Nicholson & Wilson，2003)，微生物還能與宿主代謝互作產(chǎn)生維持宿主正常免疫的代謝產(chǎn)物，如小肽、多胺和甲基供體等(Nicholsonetal.，2012)。

美洲大蠊Periplanetaamericana隸屬于蜚蠊目Blattaria蜚蠊科Blattidae大蠊屬Periplaneta，雜食特性和超強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力使其成為研究宿主與腸道菌群間協(xié)同進(jìn)化關(guān)系的重要模型之一(Mullins，2015)。Ondrejech(2016)以美洲大蠊為模型研究腸道菌群與宿主關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，使用抗生素消除腸道菌群后，宿主的代謝速率減緩且體質(zhì)量降低，表明腸道菌群可能為宿主提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)。Sabree等(2009)在構(gòu)建美洲大蠊的內(nèi)共生菌——蟑螂桿狀體屬Blattabacterium的消化通路時，發(fā)現(xiàn)內(nèi)共生菌能為宿主提供自身不能合成的氨基酸和維生素等，以提高宿主對營養(yǎng)不均衡食物的利用率。美洲大蠊腸道菌群具有高度多樣性的特征，劉曉飛等(2015)采用體外培養(yǎng)從美洲大蠊成蟲腸道中分離出20種細(xì)菌，它們多數(shù)屬于變形桿菌門Proteobacteria和擬桿菌門Bacteroidetes這兩大類昆蟲腸道優(yōu)勢菌門。Bagde等(2013)在研究美洲大蠊成蟲腸道時發(fā)現(xiàn)，可培養(yǎng)細(xì)菌不僅有芽孢桿菌屬Bacillus，還有腸桿菌屬Enterobacteria、志賀氏桿菌Shigasbasillus等機(jī)會致病菌，還有傷寒沙門氏菌Salmonellatyphi等致病菌。這些研究多集中在腸道菌群功能及它們是否能體外培養(yǎng)等方面，對美洲大蠊成蟲腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究較為缺乏。本研究采用16S rRNA高通量測序技術(shù)研究美洲大蠊成蟲腸道菌群多樣性，避免遺漏體外不能分離培養(yǎng)的細(xì)菌，以期鑒定出更全面的美洲大蠊腸道菌群群落，深入研究腸道菌群與宿主相互關(guān)系。

1 實驗方法

1.1 實驗材料

實驗采用的美洲大蠊成蟲來源于四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司美洲大蠊養(yǎng)殖基地。隨機(jī)選取6只成蟲，饑餓24 h，在無菌室用75%乙醇表面消毒30 s，再用無菌水漂洗3次。剪去蟲體的翅膀和腿，用大頭針固定頭部，從背面中部的肛門開始剪開，直到頭部。將整個腸道移到2 mL EP管中，-80 ℃保存(Carrascoetal.，2014)。

1.2 總DNA提取和PCR擴(kuò)增及測序

混合6個腸道樣品后用液氮研磨。參考十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取總DNA(李鈞敏，金則新，2006)。瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，無菌水稀釋樣品至1 ng·μL-1。使用16S rRNA V4可變區(qū)的通用引物：515F(GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)、806R(GGACTACNNGGGTATCTAAT)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20 μL體系包括：High-Fidelity PCR Master Mix 10 μL，帶Barcode的特異引物各1 μL，高保真酶0.3 μL，模板DNA 1 μL，剩余部分由ddH2O補(bǔ)齊，反應(yīng)程序為：98 ℃ 1 min；30個循環(huán)(98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)；72 ℃ 5 min。產(chǎn)物送北京諾禾致源科技有限公司用HiSeq PE250平臺測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

參照Qiime(V1.7.0，http：//qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)的Tags質(zhì)量控制流程對獲得的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和過濾處理。將處理后的數(shù)據(jù)以97%的一致性利用Uparse(Edgar，2013)全部聚類成操作分類單元(OTUs)。同時選取OTUs的代表性序列，使用Mothur(Wangetal.，2007)與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(Quastetal.，2013)進(jìn)行物種注釋分析并統(tǒng)計各樣本的菌群組成。

2 結(jié)果

2.1 腸道菌群門水平上的多樣性

通過16S rRNA測序檢測到細(xì)菌序列67 492條，歸類為581個OTUs，物種注釋到21個門。腸道的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門Firmicutes(56.96%)和擬桿菌門(33.13%)，其后依次為變形桿菌門(6.65%)、放線菌門Actinobacteria(1.11%)和浮霉菌門Planctomycetes(1.03%)等(表1)。

2.2 腸道菌群目水平上的多樣性

從目水平上對美洲大蠊成蟲腸道菌群組成進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，相對豐度≥0.1%的目占總目數(shù)的18.99%(15/79)。優(yōu)勢菌目主要為擬桿菌目Bacteroidales(32.11%)、芽孢桿菌目Bacillales(29.89%)、梭菌目Clostridiales(12.93%)和乳桿菌目Lactobacillales(10.73%)(表2)。

2.3 腸道菌群屬水平上的多樣性

對樣品檢測到的所有OTUs序列進(jìn)行聚類注釋后得到193個屬，其中相對豐度≥0.1%的菌屬有39個。除變形桿菌門的脫硫弧菌屬Desulfovibrio(0.94%)等6個屬、放線菌門的微球菌屬Micrococcus(1.00%)和軟壁菌門Tenericutes的無膽甾原體屬Acholeplasma(0.18%)外，其余31屬均屬于厚壁菌門和擬桿菌門這兩大優(yōu)勢菌門。厚壁菌門中的優(yōu)勢菌屬分別為葡萄球菌屬Staphylococcus(16.59%)、芽孢桿菌屬Bacillus(13.26%)和Lactobacillus(8.92%)；擬桿菌門中的優(yōu)勢菌屬為副桿菌屬Parabacteroides(10.26%)(表3)。

表1 美洲大蠊腸道菌群門類組成Table 1 The intestinal microbiota composition of Periplaneta americana on phylum category

注： 相對豐度=物種有效序列數(shù)/樣本總有效序列數(shù)； 下同

Note： Relative abundance=number of valid sequences of the species/ number of total valid sequencesl； the same below

表2 美洲大蠊腸道菌群目水平相對豐度(≥0.1%)Table 2 The intestinal microbial abundance of Periplaneta americana (≥0.1%)on order category

表3 美洲大蠊腸道菌群屬水平相對豐度(≥0.1%)Table 3 The intestinal microbial abundance of Periplaneta americana (≥0.1%)on genus category

2.4 美洲大蠊腸道優(yōu)勢菌屬中的菌種多樣性

在美洲大蠊成蟲腸道菌群中，共注釋到83種細(xì)菌，但由于測序片段較短，數(shù)據(jù)并不可信。統(tǒng)計美洲大蠊排名前5的優(yōu)勢菌屬中注釋到的菌種，葡萄球菌屬中注釋到的松鼠葡萄球菌Staphylococcussciuri(14.95%)是美洲大蠊成蟲腸道中的優(yōu)勢菌種。副桿菌屬中注釋到的菌種為Parabacteroidesmerdae。Lactobacillus中注釋到的菌種為加氏乳桿菌L.gasseri、戊糖乳桿菌L.pentosus、粘膜乳桿菌L.mucosae和動物乳桿菌L.animalis(表4)。

表4 美洲大蠊腸道優(yōu)勢菌屬中的菌種統(tǒng)計Table 4 Statistical analysis of species in the dominant genus of the Periplaneta americana intestinal microbiota

3 討論

美洲大蠊成蟲腸道菌群與其他昆蟲具有一定的相似性，以厚壁菌門、擬桿菌門為主要優(yōu)勢類群(Sabree & Moran，2014；Douglas，2015)，這2個菌門中的許多種類能夠消化纖維素、碳水化合物和蛋白質(zhì)等。例如，厚壁菌門的優(yōu)勢菌屬芽孢桿菌屬和Lactobacillus為發(fā)酵類細(xì)菌，它們不僅能夠利用碳水化合物生成乳酸，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，還可以產(chǎn)生細(xì)菌素等物質(zhì)抵抗真菌的侵害(Inglinetal.，2015)；擬桿菌門類桿菌屬Bacteroides的大部分細(xì)菌擁有水解多糖的酶，能夠把復(fù)雜的多糖轉(zhuǎn)變成簡單的可供宿主利用的營養(yǎng)物質(zhì)(Xuetal.，2007)。除此之外，有研究發(fā)現(xiàn)變形桿菌門的優(yōu)勢菌屬脫硫弧菌屬是存在于人體腸道內(nèi)常見的條件致病菌，它們在無氧條件下可將硫酸鹽還原為對腸道上皮細(xì)胞具有毒性作用的硫化物，還可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的異常增殖，造成非炎癥性腸病等(Loubinouxetal.，2002)，而其在美洲大蠊腸道中的作用有待進(jìn)一步研究。放線菌門的許多種類能夠參與宿主的碳氮循環(huán)和抵抗病菌侵染(Flint，2011；張曉杰等，2016)。這些主要優(yōu)勢菌門和其他一些菌屬的存在為美洲大蠊的生長、發(fā)育和繁殖提供了有利的保障。

Bertino-Grimaldi等(2013)對美洲大蠊成蟲腸道菌群研究時發(fā)現(xiàn)，其優(yōu)勢菌門為擬桿菌門和變形桿菌門，這與本研究結(jié)果差異較大。這種差異的產(chǎn)生可能與美洲大蠊的來源有關(guān)，本研究檢測的是人工飼養(yǎng)種群，而Bertino-Grimaldi等(2013)檢測的是野生種群。研究表明，美洲大蠊腸道微生物能夠隨著宿主飲食的改變而改變，當(dāng)它取食高纖維食料時，厚壁菌門顯著增加(Danielleetal.，2013)，取食高蛋白食料時腸道菌群的豐富性增加(Pérezcobasetal.，2015)。本實驗所采用的樣本為人工飼養(yǎng)種群，其生存條件和攝取的營養(yǎng)物質(zhì)與生活在環(huán)境較為惡劣的下水道等地的野生種群有很大差異，所以與其他研究結(jié)果中優(yōu)勢菌門不一致是合理的。由于16S rRNA高通量測序片段較短，許多序列并不能注釋到種，注釋到種的結(jié)果可信度也不高。因此，只對排名前5的優(yōu)勢菌屬中注釋到的細(xì)菌進(jìn)行了統(tǒng)計。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢菌種為葡萄球菌屬的松鼠葡萄球菌，它是一種常見的動物病原菌，不但能引起黃鱔Monopterusalbus、黃喉擬水龜Mauremysmutica等動物感染，還能引起人腦膜炎、尿路等感染(段薈芹，王利，2015)，但它是否會引起人工飼養(yǎng)的美洲大蠊患病尚無研究。Lactobacillus中的戊糖乳桿菌在人類腸道中占優(yōu)勢，能夠幫助宿主降解肉類食物，同時還能夠通過產(chǎn)生過氧化氫來幫助宿主抵抗致病菌的侵染(Tailliez，2004)。據(jù)此推測，它可能為美洲大蠊腸道中的益生菌，但其具體功能有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊腸道菌群種類豐富，這可能與美洲大蠊適應(yīng)性強(qiáng)、生存力強(qiáng)、食性雜有關(guān)。本研究為美洲大蠊與其腸道菌群之間的關(guān)系研究提供一定的理論參考，也為美洲大蠊的健康養(yǎng)殖提供了新思路。