鹽穗木青貯中乳酸菌的分離及篩選

尹雪，郭雪峰,2，劉俊峰,2，張秀萍,2，席琳喬,2，張?zhí)K江,2

（1塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾843300）

0 引言

【研究意義】鹽穗木（Halostachys caspica（M.B.）C. A. Mey.），屬黎科（Chenopodiaceae），鹽穗木屬（Halostachys C. A. Mey.），主要分布于中國新疆和甘肅等地，在新疆主要分布于阿克蘇地區(qū)、和田地區(qū)、巴音郭楞蒙古自治州和吐魯番等地區(qū)[1]。鹽穗木是生長在荒漠及半荒漠的鹽堿地的優(yōu)良植物，同時也是反芻動物的主要飼料之一。在粗飼料資源匱乏的新疆南疆地區(qū)，鹽穗木是良好的飼用牧草，其適口性很好，粗蛋白含量接近于苜蓿，山羊、驢、綿羊和駱駝都喜食[2]?！厩叭搜芯窟M展】合理利用飼草資源的最好方法是，適時刈割將其制成青貯。乳酸菌在青貯過程中起關(guān)鍵性作用，在厭氧條件下其能產(chǎn)生乳酸，使青貯飼料的pH迅速降低，促進飼料發(fā)酵，抑制有害微生物生長，從而使飼料得以長期保存[3-4]。乳酸菌是指能發(fā)酵碳水化合物，產(chǎn)生乳酸，革蘭氏染色呈陽性，過氧化氫酶呈陰性的一類細菌的總稱。根據(jù)菌種形態(tài)的不同，可將乳酸菌分為乳酸桿菌和乳酸球菌[5]。根據(jù)其新陳代謝和發(fā)酵形式的不同可分為同型發(fā)酵型乳酸菌和異型發(fā)酵型乳酸菌[6]?！颈狙芯壳腥朦c】目前對于鹽穗木的研究涉及藥物化學(xué)、形態(tài)學(xué)、生理學(xué)等方面的內(nèi)容較多，對于鹽穗木青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)和青貯中微生物的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用新疆阿克蘇地區(qū)鹽穗木制作實驗室自然發(fā)酵小劑量青貯，發(fā)酵完成后測定青貯營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)，并通過實驗室純培養(yǎng)結(jié)合16S rDNA基因序列分析方法，對鹽穗木青貯中的乳酸菌進行分離鑒定。以期為提高飼料資源利用率和改善青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)提供優(yōu)質(zhì)乳酸菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2016年10月從新疆阿克蘇地區(qū)隨機采集花果期鹽穗木樣品，新鮮原料除去泥土雜質(zhì)平鋪自然晾干，使水分含量達到65%—70%。將其切短至1—2 cm，裝入青貯罐中壓實并密封，每罐2 kg，共制作3罐，置于18—23 ℃條件下，自然發(fā)酵150 d。由塔里木大學(xué)畜牧科技重點實驗室草食家畜營養(yǎng)研究室制作，并保藏備用。同時測定原料的化學(xué)成分，結(jié)果見表1。

表1 青貯前鹽穗木的化學(xué)成分（%，以干物質(zhì)為基礎(chǔ)）Table 1 The chemical composition of Halostachys caspica before ensiling

1.1.2 主要試劑和儀器 主要試劑：細菌提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、T4連接盒和通用型DNA純化回收試劑盒，均購自天根生化科技有限公司；引物FA-27F: 5′-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3′，RA-1495R: 5′-AGCGGAT CACTTCACACAGGACTACGGGTACCTTGTTACG A-3′，均購自北京英俊生物技術(shù)公司。

主要儀器：超凈工作臺（SW-CJ-2FD，上海博迅實業(yè)有限公司）；電子天平（XP603S，瑞士梅特勒-托利多中國公司）；高壓滅菌鍋（SX-500，上海法潤科學(xué)儀器有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP9162，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；紫外可見光分光光度計（T6，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；PCR儀（Eppendorf，德國）；離心機（Eppendorf，德國）；旋渦混合器（HMS-350，金壇市科析儀器有限公司）；電泳儀（JY-300C，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；凝膠成像儀（GEL DOC XR，北京賽百奧科技有限公司）；pH計（PHSJ-5，上海儀電科學(xué)儀器有限公司）；超低溫冰箱（海爾集團公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基 Man, Rogasa and Sharpe （MRS）固體培養(yǎng)基[7]：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，檸檬酸二銨2 g，硫酸鎂0.05 g，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉5 g，吐溫-80 1 g，硫酸錳0.05 g，碳酸鈣1 g，瓊脂15 g，溶于1 L去離子水，121 ℃滅菌20 min。

PYG培養(yǎng)基[7]：蛋白胨0.5 g、胰蛋白胨0.5 g、酵母粉1.0 g、鹽溶液 4.0 mL（4℃保存）、葡萄糖3 g、吐溫80 0.05 mL、瓊脂0.6 g、溴甲酚紫0.14 mL，溶于100 mL去離子水，121 ℃滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 鹽穗木青貯飼料營養(yǎng)成分分析及發(fā)酵品質(zhì)測定 青貯中的營養(yǎng)成分按常規(guī)方法[8]測定：pH采用四分法取各青貯罐中的樣品，用pH計測定樣品pH；干物質(zhì)采用烘干法測定；粗蛋白采用凱氏定氮法測定；中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維采用范式纖維分析法測定；氨態(tài)氮采用分光光度計法測定；可溶性糖采用硫酸-蒽酮比色法測定[9]；用高效液相色譜儀測定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量[10]。

1.2.2 乳酸菌的分離 在超凈工作臺中分別稱取 3罐青貯，每罐10 g鹽穗木青貯樣品放入90 mL無菌蛋白胨水中，密封，置于搖床上以120 r/min搖動2 h，吸取1 mL上清液加入到9 mL無菌蛋白胨水中，漩渦振蕩，以此稀釋成10-5、10-6、10-7、10-8等 4個梯度，分別取4個梯度的菌液100 μL涂布于固體 MRS平板培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48—72 h，根據(jù)菌落顏色、大小、光澤、是否有透明圈等挑取單菌落，在 MRS固體培養(yǎng)基上劃線，恒溫培養(yǎng)30 ℃，48—72 h，重復(fù)劃線分離培養(yǎng)3次，得到純化的單菌株。用MRS液體培養(yǎng)基富集（30 ℃，24 h），與等體積的甘油混合，封裝，-70 ℃保存?zhèn)溆肹11]。

1.2.3 測定生長曲線 將乳酸菌菌液以 6.0%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)。每隔2 h測其OD值，波長600 nm，每次測三組平行樣，測定時間為0—24 h。測定完成后取3組平行試驗所測結(jié)果，計算平均值繪制統(tǒng)計圖[14]。

1.2.4 產(chǎn)酸速率測定 將乳酸菌菌懸液以3.0%的接種量接種到pH 6.5的MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37 ℃，恒溫培養(yǎng)時間 24 h。每隔2 h測定發(fā)酵液pH，每次測3組平行樣并計算平均值，根據(jù)不同發(fā)酵時間對應(yīng)的發(fā)酵 pH平均值的變化繪制產(chǎn)酸速率曲線[14]。

1.3 乳酸菌的鑒定

1.3.1 生理生化鑒定 將保存?zhèn)溆玫木昊罨?4 h，進行革蘭氏染色，觀察菌落的顏色、形態(tài)和大小等，參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和 《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》進行乳酸菌生理生化特性鑒定[7,11-13]；葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗和碳源發(fā)酵試驗采用細菌微量生化反應(yīng)進行鑒定；耐鹽試驗、耐酸試驗和溫度生長試驗參考文獻[7,11]進行。

1.3.2 提取細菌DNA和PCR擴增 用細菌提取試劑盒提取細菌DNA，并用PCR儀對各個菌株的DNA進行擴增，擴增引物為27F和1495R，所使用擴增反應(yīng)的體系為 50 μL，體系如下：5 μL 10×Buffer，4 μL dNTP Mixture，0.5 μL Taq 酶，2 μL DNA 模板，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，無菌超純水補足至50 μL后進行PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃，3 min；94 ℃，1 min；53 ℃，1 min；72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸8 min，用1%的瓊脂糖凝膠電泳對擴增的PCR產(chǎn)物進行檢測。將PCR 產(chǎn)物回收后，連接 p MD-18T 載體并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，經(jīng)藍白斑篩選為陽性克隆后送武漢華大基因科技有限公司測序。

1.3.3 16S rDNA基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 利用核酸 Blast技術(shù)，將所測序列與NCBI 網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫進行對比，選擇與所測序列同源性最高的已知分類地位的菌種。從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載已知菌株的16S rDNA基因序列，與所測菌株的 16S rDNA序列一起，采用 Clustal 進行比對，并用 MEGA5.0繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，確定各菌株分類地位[15]。

2 結(jié)果

2.1 鹽穗木青貯的營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)分析

自然發(fā)酵鹽穗木青貯發(fā)酵第150天后的化學(xué)組成如表2所示。與青貯前相比，發(fā)酵后鹽穗木青貯的干物質(zhì)和可溶性糖含量均降低，粗蛋白、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量均呈上升狀態(tài)。

自然發(fā)酵鹽穗木青貯發(fā)酵品質(zhì)如表3所示。150 d開罐時鹽穗木青貯的pH為4.254—4.268，屬于優(yōu)良品質(zhì)青貯飼料pH 3.8—4.5的范圍。發(fā)酵期結(jié)束后，青貯中乳酸含量較高，且未檢測到丁酸。

表2 青貯后鹽穗木的化學(xué)成分（%，以干物質(zhì)為基礎(chǔ)）Table 2 The chemical composition of Halostachys caspica after ensiling

表3 鹽穗木青貯的發(fā)酵品質(zhì)（mg·mL-1）Table 3 Fermentation characteristics of Halostachys caspica silage

2.2 乳酸菌菌株形態(tài)特征分析

本試驗根據(jù)菌落特征篩選出 12株符合特征的乳酸菌，編號為 H1—H12，挑取單菌落經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，再根據(jù)菌體特征和接觸酶反應(yīng)，初步確定9株菌為乳酸菌，其中桿菌5株，球菌4株，結(jié)果如表4所示。

表4 鹽穗木青貯中乳酸菌的形態(tài)特征Table 4 Morphological characteristics of lactic acid bacteria fertilizer in Halostachys caspica

2.3 乳酸菌菌株的生理生化特性

產(chǎn)酸速率和生長速率是篩選優(yōu)良乳酸菌的重要指標(biāo)，從圖1中可見，本試驗分離得到的9株乳酸菌的產(chǎn)酸能力較強，在24 h之內(nèi)菌液的pH值均能降到4.5以下，其中菌株H10和H2產(chǎn)酸能力較強，pH降至3.649和3.676。菌株H1、H11和H12產(chǎn)酸能力最弱，pH降至4.344、4.351和4.348。菌株H3和H8在16 h時pH達到3.8左右后，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌液pH不再下降且有回升趨勢。因此，可看出各菌株產(chǎn)酸能力強弱依次為H10、H2、H9、H8、H3、H5、H1、H12和H11。從圖2中可見，在培養(yǎng)2 h后各菌株均進入對數(shù)生長期，其中菌株H10、H2和H9生長速率最快且在培養(yǎng)至24 h時沒有出現(xiàn)遲滯期。菌株H3和H8在2—16 h生長較快，但在16 h以后就進入了衰亡期。整體上，菌株H1、H5、H11和H12的生長較慢。因此，可以看出各菌株繁殖速率強弱依次為H10、H2、H9、H3、H8、H5、H11、H1 和 H12。

9株乳酸菌生理生化指標(biāo)及碳源利用方式鑒定結(jié)果見表5和表6。由表5可看出，產(chǎn)氣試驗中6株乳酸菌發(fā)酵葡萄糖均不產(chǎn)氣，為同型發(fā)酵乳酸菌，菌株H3和H8發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生氣體，為異型發(fā)酵乳酸菌，9株菌均能發(fā)酵葡萄糖并產(chǎn)酸。在5℃菌株H2和H10能良好生長，H1、H5、H11和H12 4株菌生長較弱，菌株H3、H8和H9不能生長；在10、40和45℃，9株乳酸菌生長良好；NaCl濃度為3%和6.5%時9株菌均能生長；在pH3條件下菌株H1、H5、H11和H12株不能生長，其余菌株生長良好；在pH值為4—7時9株菌均生長良好；在 pH8時乳酸菌 H1、H5、H11和H12不能生長。

圖1 乳酸菌菌株產(chǎn)酸速率曲線Fig. 1 Acid-producing rate curve of lactic acid bacterium strains

由表6可知：9株菌均可利用D-葡萄糖、D-甘露糖、纖維二糖、D-甘露醇、D-果糖、蔗糖、D-山梨醇、苦杏仁苷和D-蜜二糖；H1、H5、H11和H12菌株均不能發(fā)酵L-山梨糖、D-松二糖、木糖醇、D-棉籽糖、D-核糖和L-鼠李糖；H3和H8菌株均不能利用乳糖、L-山梨糖、D-松二糖、木糖醇、D-棉籽糖、D-核糖和L-鼠李糖；菌株H2不能發(fā)酵L-山梨糖、D-松二糖、D-松三糖、木糖醇、D-棉籽糖和D-木糖；菌株H9不能利用 L-山梨糖、D-松二糖、木糖醇、D-核糖、L-鼠李糖和D-木糖；菌株H10不能利用D-麥芽糖、乳糖、D-半乳糖、L-山梨糖、D-松二糖、木糖醇、D-棉籽糖、D-核糖和L-鼠李糖。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

對篩選出的9株乳酸菌提取基因組DNA，采用細菌通用引物對其16S rDNA序列擴增，片段大小為1 500 bp左右。測序獲得的細菌序列通過BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比對分析見圖3，菌株H1、H11和H12與數(shù)據(jù)庫中的Enterococcus faecium同源性為99%，菌株H5與數(shù)據(jù)庫中Enterococcus lactis的同源性為99%，菌株H3和H8與數(shù)據(jù)庫中的Bacillus cereus同源性為99%，菌株H2與數(shù)據(jù)庫中的Lactobacillus pentosus有 100%的同源性，菌株 H9與數(shù)據(jù)庫中的Lactobacillus plantarum subsp. plantarum同源性為100%，菌株H10與數(shù)據(jù)庫中的Lactobacillus buchneri有100%的同源性。依據(jù)16S rDNA基因序列的同源性分析，確定菌株 H1、H11和 H12為糞腸球菌（Enterococcus faecium），菌株H5為屎腸球菌（Enterococcus lactis），菌株H3和H8為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus），菌株 H2為戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus），菌株 H9為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），菌株H10為布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）。

圖2 乳酸菌菌株生長曲線Fig. 2 Growth curve of lactic bacterium strains

表5 乳酸菌生理生化鑒定Table 5 Physiological and biochemical property of lactic acid bacterium strains

圖3 乳酸菌基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of the lactic bacterium strains according to 16S rDNA sequences

表6 乳酸菌碳源發(fā)酵試驗Table 6 Carbon source tests for lactic acid bacteria fermentation

3 討論

現(xiàn)有研究對于鹽穗木青貯后營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)的報道幾乎未見，本研究采集阿克蘇地區(qū)花果期鹽穗木，自然發(fā)酵150 d后測定其營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)。結(jié)果顯示，青貯后鹽穗木干物質(zhì)和可溶性糖的含量低于青貯前，造成這種結(jié)果可能的原因是，青貯飼料在發(fā)酵過程中乳酸菌發(fā)酵利用原料中的糖類物質(zhì)，在青貯發(fā)酵初期乳酸菌將原料中的可溶性糖轉(zhuǎn)化為乳酸，使乳酸含量急劇增加，降低青貯pH，抑制有害微生物生長，從而減少青貯過程中的營養(yǎng)損失[16-18]。與青貯前的原料相比，發(fā)酵期結(jié)束后鹽穗木的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量高于原料中的含量，可能是由于在青貯發(fā)酵過程中鹽穗木莖稈中難降解的水溶性碳水化合物被乳酸菌降解為中性洗滌纖維，導(dǎo)致其含量升高。綜上所述，本試驗制作的小劑量鹽穗木青貯品質(zhì)良好，可為篩選優(yōu)質(zhì)乳酸菌提供原料，并為鹽穗木青貯的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

乳酸菌的快速繁殖和青貯中 pH的迅速降低是保證青貯成功的關(guān)鍵，要制作品質(zhì)良好的青貯，篩選優(yōu)質(zhì)的乳酸菌就顯得尤為重要。本研究從自制鹽穗木青貯中篩選出的糞腸球菌、屎腸球菌、蠟狀芽孢桿菌、戊糖乳桿菌、植物乳桿菌和布氏乳桿菌能夠利用多種碳源，產(chǎn)酸速率和生長速率較好，尤其是菌株戊糖乳桿菌、植物乳桿菌和布氏乳桿菌在24 h內(nèi)pH降至3.8以下，并且在pH3條件下生長旺盛，說明這3株菌都具有很強的產(chǎn)酸和耐酸能力，可成為青貯飼料添加乳酸菌的備用菌株。

研究表明同型發(fā)酵乳酸菌對飼料具有保鮮作用，異型乳酸菌能有效防止飼料二次發(fā)酵，將同型發(fā)酵乳酸菌與異型發(fā)酵乳酸菌混合使用不僅可以提高青貯的有氧穩(wěn)定性，還有利于飼料中養(yǎng)分的保存，對青貯飼料長期保存十分有利[19-20]。本試驗從青貯150 d的鹽穗木樣品中分離出6株同型發(fā)酵乳酸菌和3株異型發(fā)酵乳酸菌，適當(dāng)組合并優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵工藝使其可以更好的用于優(yōu)質(zhì)青貯的制作中。

國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)可的飼用微生物有很多，包括本試驗分離出的糞腸球菌、屎腸球菌、戊糖乳桿菌、植物乳桿菌和布氏乳桿菌。研究表明，在動物飼料中添加一定量的糞腸球菌或屎腸球菌可促進畜禽對碳水化合物的消化，并且不會對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生負(fù)面影響[21]，本研究從鹽穗木青貯中分離出4株生長性能良好的腸球菌，期待其能成為對反芻動物有利的微生物添加劑。對于戊糖乳桿菌和植物乳桿菌的發(fā)酵條件的研究較為深入，將戊糖乳桿菌或植物乳桿菌與芽孢桿菌制成復(fù)合菌液，添加到飼料中可增強動物胃腸的消化能力，提高飼料利用率和產(chǎn)奶量[22-23]。本研究后期將會對此次分離出的植物乳桿菌、戊糖乳桿菌和其他優(yōu)質(zhì)菌株進行優(yōu)化組合，期待其能成為對動物有益的復(fù)合菌液。MANGWE[24]等的研究表明，向青貯飼料中添加布氏乳桿菌，可以顯著提高飼料的有氧穩(wěn)定性，增加青貯中單寧的含量，提高了飼料的適口性。本研究分離出的布氏乳桿菌生長速率快、耐酸耐鹽性強，在 5—45℃可良好生長，這與杜志琳[25]的研究結(jié)果基本一致，可將其作為青貯發(fā)酵劑。

4 結(jié)論

本研究首次測定分析了鹽穗木青貯后的營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)，結(jié)果顯示將鹽穗木制成青貯后其營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)均處于良好水平。同時從自制自然發(fā)酵青貯中分離出9株乳酸菌，經(jīng)生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，最終篩選出3株糞腸球菌，1株屎腸球菌，2株蠟狀芽孢桿菌，1株戊糖乳桿菌，1株植物乳桿菌和 1株布氏乳桿菌，其中戊糖乳桿菌和布氏乳桿菌可在 pH3—8，5—45℃溫度范圍條件下較好生長。后期將對戊糖乳桿菌、布氏乳桿菌和植物乳桿菌的發(fā)酵條件、抑菌能力及在青貯中的使用效果進行進一步研究，使其能更好的應(yīng)用于青貯飼料的制作中。