藍莓紅酒發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

聶文強，吳天祥，2，鄒 雪

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州大學明德學院，貴州貴陽550025；3.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心，貴州貴陽550001）

藍莓紅酒作為一種特殊的漿果發(fā)酵果酒，它有獨特的風味與營養(yǎng)成分。首先，藍莓紅酒具有鮮艷誘人的紫紅色，滿足了消費者對果酒的感官享受。其次，藍莓紅酒具有果香清香優(yōu)雅，酸爽平衡的口感，滿足消費者特別是女性消費者需求。并且，科學的發(fā)酵工藝所生產的藍莓紅酒，富含多種有益健康的礦物質、維生素、氨基酸、微量元素及有機酸等，具有營養(yǎng)價值高、糖分低、酒度低的特點，其中所含的高水平的抗氧化物，有助于提高免疫力，抵抗疾病的特點[1-3]。

本研究以貴州麻江藍莓為原料，采用單因素及正交試驗對藍莓紅酒釀造工藝參數(shù)進行優(yōu)化，旨在探討影響藍莓紅酒發(fā)酵的諸因素，為藍莓紅酒的工業(yè)化生產提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌種：本實驗室篩選后保藏菌株Z2以及活性干酵母，市售；酵母詳細信息見表1；藍莓，采自貴州省麻江縣藍莓種植基地。

表1 紅酒實驗活性干酵母簡介

試劑：乙酸正丁酯標準品，1+1鹽酸溶液，沒食子酸，單寧酸，NaOH（200 g/L）標準液，NaOH（0.05 mol/L）標準液，斐林溶液Ⅰ、Ⅱ液，葡萄糖標液，磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，福林-肖卡試劑，福林-丹尼斯試劑，白酒混合標準品（mg/L）由中國科學院蘭州化學物理研究所色譜技術研究開發(fā)中心提供。果膠酶EX-V，購于拉曼公司。

儀器設備：pH計；恒溫培養(yǎng)箱；搖床；手持糖度計；凈化工作臺；數(shù)顯鼓風干燥箱；高壓蒸汽滅菌鍋；電子分析天平；紫外可見分光光度計；水浴鍋；安捷倫氣相色譜儀附FID檢測器；AT.LZP-930白酒專用色譜柱，規(guī)格25 m×0.32 m×0.25 μm。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素實驗

1.2.1.1 最佳pH值的選擇

冷凍藍莓升溫至室溫,破碎打漿，加入40 mg/L的SO2，調整糖度至22 °Bx，調整pH值為2.9、3.2、3.5、3.8、4.1，加入4 g/L橡木粉，加入600 mg/L磷酸氫二銨，加入10 mg/L LAFASE HE果膠酶，28℃浸漬1 h，70℃加熱處理30 min鈍化果膠酶。研究發(fā)酵pH值對藍莓紅酒中甲醇、雜醇油、感官品質的影響，選擇最佳發(fā)酵pH值，每組兩個平行。

1.2.1.2 最佳發(fā)酵溫度的選擇

調整pH值為3.5，調整糖度至22°Bx，調整溫度為19℃、22℃、25℃、28℃、31℃。研究發(fā)酵溫度對藍莓紅酒中甲醇、雜醇油、感官品質的影響，選擇最佳發(fā)酵溫度，每組兩個平行。其他條件同1.2.1.1。

1.2.1.3 最佳糖度的選擇

調整pH值為3.5，調整溫度為25℃，調整糖度為16 °Bx、19 °Bx、22 °Bx、25 °Bx、28 °Bx，研究糖度對藍莓紅酒中甲醇、雜醇油、感官品質的影響，選擇最佳糖度，每組兩個平行。其他條件同1.2.1.1。

1.2.2 正交實驗設計

在單因素實驗結果的基礎上，進行正交實驗。正交實驗的表頭設計選取4因素3水平表L9(34)，pH值為3.2、3.5、3.8，發(fā)酵溫度為25 ℃、28℃、30℃，糖度為19 °Bx，22 °Bx，25 °Bx，試驗設置兩個重復；實驗結果的主要參考指標為甲醇、雜醇油含量與感官評價。之后對品評結果進行統(tǒng)計分析。

1.3 分析方法

1.3.1 基本理化指標

pH值：酸度計法；總糖：直接滴定法；總酸：電位滴定法；酒精度：密度瓶(GB/T 15038—2006)。

1.3.2 色度

色度測定：樣品經0.45 μm孔徑濾膜過濾后，測定其pH值，用相同pH值的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋10倍后于分光光度計上全波段掃描（400～700 nm）確定最大吸收峰；在420 nm、620 nm和最大吸收峰處分別測定吸光值，將三者吸光值相加乘以10即得色度值[4]。

1.3.3 單寧

單寧，福林-丹尼斯法[5]：以單寧酸為標準品，以吸光度為縱坐標，以不同單寧酸濃度（mg/L）為橫坐標，繪制標準曲線，見圖1。

樣品的測定：吸取10 mL酒樣稀釋到100 mL，然后再取1 mL進行處理后在760 nm波長處測定吸光度。

1.3.4 總酚

采用福林-肖卡法(GB/T 10345—2007)，以沒石子酸為標準品，以吸光度為縱坐標，以不同沒石子酸濃度（mg/L）為橫坐標，繪制標準曲線，見圖2。

圖1 單寧含量標準曲線圖

圖2 總酚含量標準曲線圖

樣品測定：吸取10 mL酒樣先稀釋到100 mL，然后再取1 mL進行處理后在765 nm波長處測定吸光度。

1.3.5 花色苷

pH示差法[6]：用移液管吸取5 mL酒樣，稀釋到50 mL，再從稀釋液中取2 mL，分別用 pH1.0的KCl-HCl混合液和pH4.5的NaAc-HAc緩沖溶液稀釋至10 mL混勻，以等量溶劑加相應緩沖溶液做空白樣，測定520 nm和700 nm處吸光值?？偦ㄉ盏暮恳允杠嚲丈?3-葡萄糖苷計，按下式算：

其中：n表示稀釋倍數(shù)；449.2是矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾質量；26900是矢車菊色素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)。

1.3.6 甲醇及雜醇油

采用氣相色譜分析，氫火焰離子化檢測器，以白酒標樣標準圖譜的各組分保留時間定性，乙酸正丁酯峰面積內標法定量，同時測定葡萄酒中的甲醇、異丁醇、異戊醇等物質含量[7]。

色譜條件：載氣：高純氮氣99.999%，流速為1.0 mL/min；分流比：1∶35；尾吹：30 mL/min；高純氫氣：99.999%，流速為40 mL/min；空氣：流量400 mL/min；檢測器溫度：230℃；進樣口溫度：210℃；柱溫：初溫35℃，保持5 min，以7℃/min的速率升至100℃，保持恒溫2 min，再以10℃/min的速率升至150℃，保持恒溫4 min。

相對較正因子（f值）的測定：待色譜儀基線穩(wěn)定之后，吸取白酒混標溶液0.2 μL進樣分析，記錄白酒混標中各組分和內標的保留時間及峰面積，用其比值算出各物質的相對較正因子。

式中：f為各組分的相對較正因子；A2為混標中內標峰面積；A1為混標中各組分峰面積；M1為混標中各組分濃度(mg/L)；M2為混標中內標物濃度(mg/L)。

樣品測定：準確稱取內標物乙酸正丁酯1.0022 g，用60%色譜純乙醇溶液定容至25 mL，取200 μL內標溶液，用蒸餾后的酒樣定容到10 mL，混勻，樣品中內標濃度為801.76 mg/L，與f值測定相同的條件下進樣，進樣量l μL。

式中：X為樣品中各組分濃度，mg/L；A3為樣品中各組分峰面積；A4為樣品中內標峰面積；f為各組分的相對較正因子；C為樣品中內標物濃度，mg/L。

1.3.7 香氣成分

先將10.0 mL樣品加入15 mL樣品瓶中，加入2.5 g氯化鈉，插入裝有2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動進樣器，60℃頂空萃取30 min。

實驗譜圖分析：對總離子流譜圖進行Nist2005和Wiley275譜庫檢索，確定揮發(fā)性成分，并用峰面積歸一化法計算各成分的相對百分含量。

1.3.8 感官評定

在室溫20℃左右，濕度60%～70%之間，光線良好，干凈通風無異味的室內。由7位具相關品評經驗人員對藍莓半甜紅酒進行品評。包括觀色（流動性，氣泡，顏色，透明度，掛杯性）、聞香（果香，酒香）、品嘗（酸，甜，苦澀，酒精，余味）、寫評語、打分。每個評酒員按細則要求在給定分數(shù)內逐項打分，累計總分，再把每個評酒員的分數(shù)相加，取平均值為該酒的感官評定分數(shù)。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗（圖3、圖4、圖5）

實驗結果表明，Z2發(fā)酵藍莓紅酒的酒精度，隨pH值的升高而升高，從pH2.9時的11.95%vol升高到pH4.1時的12.12%vol；酒精度隨糖度的升高而升高，從糖度為16°Bx時的8.76%vol升高到糖度為28°Bx時的15.34%vol；酒精度隨發(fā)酵溫度的升高而降低，從19℃時的12.17%vol降低到31℃時的11.92%vol。

由圖4可知，隨pH值的升高，糖消耗量增加，發(fā)酵完成后總糖含量低，極有可能是由于在pH4.1、溫度為31℃時接近酵母的最佳生存條件，酵母的生理活動比較旺盛，消耗更多的糖。發(fā)酵時的糖度越高，酵母在一定的發(fā)酵時間內未完成發(fā)酵，紅酒中的總糖含量就比較高。

上述實驗結果表明，發(fā)酵溫度對藍莓紅酒中總酸的影響不大，隨著溫度的變化，總酸一直處于7.45～7.8 g/L的范圍內。糖度為16°Bx時候的總酸約為6.5 g/L，可能是此時酒精度比較低，酸類物質未全溶解進入紅酒內，當酒精度升高到一定的范圍后，藍莓紅酒中總酸保持約7.5 g/L的穩(wěn)定狀態(tài)。pH值對藍莓紅酒的酸度影響比較大，在調整藍莓果漿pH值時加入的CaCO3中和了藍莓中的酒石酸形成了酒石酸鹽沉淀，從而降低了藍莓紅酒中的總酸含量。

圖3 單因素對藍莓紅酒酒精度的影響

圖4 單因素對藍莓紅酒總糖的影響

圖5 單因素對藍莓紅酒總酸的影響

單因素對藍莓紅酒色澤及酚類的影響見表2。由表2可看出，藍莓紅酒的發(fā)酵溫度及糖度對色度的影響不大，色度隨著pH值的升高而降低。單寧、總酚的變化情況顯示出一致性，二者隨著pH值的增大而增大，隨著溫度的升高而高。糖度對單寧及總酚的影響不大。

表2 單因素對藍莓紅酒色澤及酚類的影響

在藍莓紅酒中，花青素不是單獨存在的，而是與糖結合在一起，以糖苷的形式存在。上述實驗得出，發(fā)酵糖度對花色苷含量的影響不大（圖6），不同糖度所發(fā)酵的不同酒精度的藍莓紅酒的花色苷含量均在255～265 mg/L的范圍內，在pH2.9～3.5時，花色苷含量的變化不大，當pH值＞3.5后，花色苷含量明顯隨著pH值的升高而降低。溫度為28℃時，發(fā)酵的藍莓紅酒的花色苷含量最高為281 mg/L，25℃時次之為278 mg/L，其余溫度所發(fā)酵的藍莓紅酒的花色苷含量均為265 mg/L左右。

圖6 單因素對藍莓紅酒花色苷的影響

圖7 單因素對藍莓紅酒甲醇及雜醇油的影響

上述實驗結果表明，藍莓紅酒中甲醇和雜醇油的量均隨著溫度和pH值的升高而升高，可能是在pH4.1與溫度31℃時，果膠酶活性較強，酵母本身增殖及裂解活力比較強，由此產生較高的甲醇及雜醇油含量(圖7)。甲醇含量隨著糖度的升高有所降低，從糖度為16°Bx時的264 mg/L降低到糖度為28°Bx時的218 mg/L，可能是由于糖度高的果漿加糖量多，所含的果膠物質相對少，由此產生的甲醇少。雜醇油隨著果漿中加入蔗糖量的增多而增多，可能可以采取分批加糖法或者改添加蔗糖為葡萄糖，但由于所產的雜醇油量最高未超過350 mg/L，沒有超過毒害標準，所以本研究未做進一步實驗。

實驗得出，在以上條件范圍內，不同發(fā)酵方法發(fā)酵的藍莓紅酒都具有紅酒的典型性，其中，pH值對色澤的影響比較大，pH3.5時的紅酒呈透明的深紫紅色（偏紅），在pH值＜3.5時，藍莓紅酒呈紫色，pH值變低，紅酒的透明度變差。在pH值＞3.5時，pH值升高，紅酒越顯紅褐色且泛藍色，有失紅酒的美感。發(fā)酵溫度對藍莓紅酒的香氣影響比較大，溫度28℃時發(fā)酵的紅酒香氣最為協(xié)調；溫度低時發(fā)酵的酒香味淡；溫度31℃時發(fā)酵的藍莓紅酒果香味略差。糖度為22°Bx時，發(fā)酵的藍莓紅酒有比較和諧的酒香味與果香味，糖度低的藍莓紅酒酒精度低，味道蒼白且酸澀味重，糖度高的酒精度太高，入口過于辛辣，有失柔和圓潤性。綜合，在單因素的感官評定最好的點附近取點進一步做正交實驗，以確定藍莓紅酒的最佳發(fā)酵條件。

圖8 單因素對藍莓紅酒感官評定的影響

2.2 正交實驗

在藍莓紅酒發(fā)酵中，根據(jù)單因素結果，用pH值、溫度、糖度進行正交分析，正交實驗設計及分析結果如表3。

由實驗得出，3個因素對藍莓紅酒感官的影響因素順序為發(fā)酵溫度＞pH值＞糖度，發(fā)酵條件最佳組合為A3B2C2（溫度30℃，pH3.5，糖度22°Bx）。

表3 正交實驗設計及結果

2.3 成品檢測

2.3.1 成品藍莓紅酒的理化指標

對藍莓果實、調整后藍莓果漿、成品藍莓紅酒進行各項指標測定，結果見表4。

表4 藍莓果實及藍莓紅酒基本指標的對比

按照正交實驗獲得的最佳條件（發(fā)酵溫度30℃、pH值3.5、糖度22°Bx）進行藍莓紅酒發(fā)酵，其酒體含有較高的總酚和花色苷含量，單寧充足且顏色較深；通過感官評價得分85.00分，且色澤深紫紅、酒體澄清透明有光澤，有較好的藍莓果香和醇香，口感略有酸味，具有典型紅酒風格。

2.3.2 4種酵母菌發(fā)酵紅酒的香味成分分析

通過氣相色譜檢測，4個酵母BV818、Z2、71 B、D254分別發(fā)酵的藍莓紅酒氣相色譜圖，結果見圖9。

圖9 4個酵母發(fā)酵的藍莓紅酒氣相色譜圖

圖9表明，氣相物質依次為醛，甲醇，正丙醇，乙酸乙酯，異丁醇，乙縮醛，正丁醇，乙酸，異戊醇，丁酸乙酯，辛酸乙酯，異丁酸，丁酸，β-苯乙醇。BV818發(fā)酵的藍莓紅酒中共檢測到12種微量成分，其中醛類物質2種，高級醇4種，酯類2種，酸類2種；Z2發(fā)酵的藍莓紅酒中共檢測到10種微量成分；其中醛類物質1種，高級醇4種，酯類1種，酸類2種；71B發(fā)酵的藍莓紅酒中共檢測到10種微量成分，其中醛類物質1種，高級醇4種，酯類1種，酸類2種；D254發(fā)酵的藍莓紅酒中共檢測到13種微量成分，其中醛類物質2種，高級醇4種，酯類2種，酸類3種；其余的為甲醇和β-苯乙醇。

3 結論

綜合上述測試及分析，藍莓紅酒中總酚、單寧和花色苷的含量隨著溫度和pH值的升高而升高。酒精度隨著糖度與pH值的升高而升高，隨著溫度的升高而降低。甲醇和雜醇油含量隨著溫度與pH值的升高而升高，雜醇油隨著糖度的升高而升高?？偹犭S著pH值的升高而減少，總糖隨著糖度的升高而升高。pH值對藍莓紅酒的色澤與口感有很大影響，溫度對香氣有很大影響，糖度對香氣與口感有很大影響。通過正交實驗得出，發(fā)酵最佳條件為發(fā)酵溫度30℃，pH3.5，糖度22°Bx。本研究及結果可為藍莓紅酒工業(yè)化生產提供理論依據(jù)，市場前景廣闊。