sEH抑制劑改善ISO誘導(dǎo)的心肌肥厚的機(jī)制研究

張煥基 陳怡錫 吳奮生 閔敏 陳子奇 袁朝漢 伍貴富

心肌肥厚是心力衰竭和心臟性猝死的重要病理性因素。盡管臨床廣泛使用的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)抑制劑、β受體抑制劑可在一定程度上逆轉(zhuǎn)心肌肥厚，但目前由心肌肥厚導(dǎo)致的心力衰竭發(fā)病率和病死率仍然居高不下，因此新藥物的研發(fā)有望為心肌肥厚的治療提供新思路[1]。我們的前期研究顯示花生四烯酸的代謝產(chǎn)物環(huán)氧二十碳三烯酸(EET)具有改善心肌肥厚的作用，但其機(jī)制目前尚未完全清楚[2]。心肌細(xì)胞凋亡在心肌肥厚的進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用，那么EET能否通過抑制心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制心肌肥厚，目前仍未明確。在本研究中，筆者擬通過使用可溶性表氧化物水解酶(sEH)抑制劑提升體內(nèi)EET水平進(jìn)而探討其改善心肌肥厚的機(jī)制。

材料與方法

一、實驗動物

SPF級雄性 SD大鼠18只，6周齡，180～200 g，由中山大學(xué)動物實驗中心提供。H9C2心肌細(xì)胞系購自美國菌種保藏中心(ATCC)。藥品與試劑：鹽酸異丙腎上腺素(ISO)注射針劑(大連美侖生物技術(shù)有限公司)，sEH抑制劑TUPs由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院黃輝課題組惠贈。Caspase 3抗體(Abcam)，兔源性二抗(Santa Cruz)。原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)試劑盒(Promega，Madison，USA)。

二、方 法

1.實驗動物模型建立和分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法將雄性SD大鼠分為3組各6只，分別為對照組(control組)、模型組(ISO組)、sEH抑制劑干預(yù)組(ISO+TUPs組)。ISO組大鼠皮下注射ISO 1 mg/(kg·d)連續(xù)14 d以建立心肌肥厚模型。ISO+TUPs組每日加予口服sEH抑制劑TUPs 0.65 mg/(kg·d)，連續(xù)14 d 。本研究遵循實驗動物倫理相關(guān)規(guī)定。

2.心臟與體質(zhì)量比值測定

末次給藥后禁食12 h，稱體質(zhì)量后安樂處死大鼠，取出心臟稱其質(zhì)量。心臟與體質(zhì)量比值=心臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

3.實時熒光定量PCR

按照Trizol RNA plus說明書提取組織總RNA，使用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并用SYBR GreenⅡ，按兩步法(95 ℃、60 ℃)進(jìn)行擴(kuò)增及檢測，每次3個復(fù)孔，總RNA每孔500 μg。心肌細(xì)胞肥大指標(biāo)心房利鈉肽(ANP)引物為：GGAGCCTGCGAAGGTCAA；TATCTTCGGTACCGGAAGCTGT；β-actin引物為：CAGATCATGTTTGAGACCTTCAA；GTGGTA-CGACCAGAGGCATACA。

4.心肌組織凋亡檢測

采用TUNEL按照試劑盒說明書操作，用二甲苯浸洗2次，每次5 min；用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)各浸洗1次，每次3 min；用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次；用Proteinase K工作液處理組織20 min， 用PBS漂洗3次，各5 min；加50 μl TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上，于37 ℃下加封口膜在暗濕盒中反應(yīng)60 min。用PBS漂洗3次，各5 min。于含辣根過氧化物酶的抗熒光素抗體37 ℃濕盒中避光30 min，用PBS漂洗3次，各5 min，用3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色5～10 min，用PBS漂洗3次，各5 min，用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核數(shù)秒，流水沖洗，脫水，透明，中性樹膠封片。心肌細(xì)胞凋亡率=凋亡心肌細(xì)胞/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。

5.免疫組織化學(xué)檢查(免疫組化)

將心肌組織的石蠟切片脫蠟至水，加入3% H2O2室溫孵育10 min，用蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min 2次，用10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min，棄去血清，滴加Caspase 3一抗(Abcam 1∶50)工作液，于37 ℃孵育 1 h。用PBS 沖洗3次各5 min，滴加生物素標(biāo)記兔源性二抗(Santa Cruz 1∶100)工作液，于37 ℃孵育20 min。用PBS沖洗3次各5 min，滴加適量的辣根酶工作液，于 37 ℃孵育20 min。用PBS沖洗3次各5 min，用DAB顯色劑顯色5 min，用自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、sEH抑制劑TUPs對ISO所致心肌肥厚的影響

14 d后3組間心臟質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.557，P=0.004)。其中，ISO 組心臟質(zhì)量與體積均較control組重/大，而這一作用可以被sEH抑制劑TUPs所抑制。同時，ISO也增加心臟與體質(zhì)量比值(ISO組vs. control組為8.650±0.768vs. 5.775±1.024，P=0.004)，而TUPs可減低心臟與體質(zhì)量比值(ISO+TUPs組vs. ISO組為6.475±0.957vs. 8.650±0.768，P=0.012)，見圖1A、B。3組間ANP表達(dá)不全相同(F=113.375，P<0.001)，其中ISO增加ANP的表達(dá)(ISO組vs. control組為2.152±0.154vs.1.037±0.039，P<0.001)，而TUPs可以降低ISO誘導(dǎo)的ANP的表達(dá)(ISO+TUPs組vs. ISO組為1.470± 0.909vs. 2.152±0.154，P=0.006)，見圖1C。

圖1 control、ISO、ISO+TUPs組心臟大體形態(tài)、心臟與體質(zhì)量比值、ANP表達(dá)

二、sEH抑制劑TUPs對心肌肥厚過程中心肌細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL染色結(jié)果提示3組間心肌細(xì)胞的凋亡率有差異(F=133.533，P<0.001)。ISO 增加了心肌細(xì)胞的凋亡率[ISO組vs. control組為(1.258±0.059)%vs. (0.431±0.098)%，P=0.019)]，而TUPs可以減少ISO所致的心肌細(xì)胞凋亡率[ISO+TUPs組vs. ISO組為(0.710±0.052) %vs.(1.258±0.059)%，P=0.018]，見圖2。另外，3組Caspase 3的表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=44.675，P<0.001)，ISO增加了Caspase 3的表達(dá)(ISO組vs. control組為1.837±0.187vs. 0.999±0.084，P=0.004)，而TUPs抑制了ISO誘導(dǎo)的Caspase 3的表達(dá)(ISO+TUPs組vs. ISO組為1.397 ±0.071vs. 1.837±0.187，P=0.033)，見圖3。

討 論

我們的在體實驗證明了sEH抑制劑TUPs能顯著改善ISO所致的心肌肥厚，這一效應(yīng)可能與TUPs抑制ISO所致的心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。心肌肥厚是心臟為適應(yīng)各種刺激如壓力增大、容量超負(fù)荷、神經(jīng)內(nèi)分泌因子過渡激活等產(chǎn)生的病理改變，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、外基質(zhì)重建等。早期改變是機(jī)體發(fā)生的適應(yīng)性改變，但到晚期，心臟發(fā)生失代償，最終可以引發(fā)心力衰竭、心臟性猝死等嚴(yán)重的心血管事件。盡管心肌肥厚的問題已被臨床廣泛關(guān)注，但目前仍沒有很有效的藥物可逆轉(zhuǎn)心肌肥厚。EET是新近發(fā)現(xiàn)的具有多種生物活性的花生四烯酸代謝產(chǎn)物[3]。sEH是EET分解代謝的主要代謝酶之一，通過抑制sEH可以提升EET水平，進(jìn)而發(fā)揮一系列心血管保護(hù)作用。有研究顯示，在自發(fā)高血壓心力衰竭大鼠和慢性心力衰竭患者中，其心臟局部14,15-環(huán)氧化二十碳(14,15-DHET)、sEH蛋白水平和基因水平表達(dá)下降，同時該研究顯示編碼sEH的基因EPHX2是心力衰竭易感基因[4]。在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥厚模型中，Ai等[5]證明AngⅡ可以增加sEH蛋白的表達(dá)，應(yīng)用sEH抑制劑可以改善AngⅡ所造成的心肌肥厚。

圖2 control、ISO、ISO+TUPs組心肌細(xì)胞凋亡水平

圖3 control、ISO、ISO+TUPs組凋亡蛋白Caspase 3表達(dá)情況(×100)

細(xì)胞凋亡是由細(xì)胞內(nèi)外各種因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而引起細(xì)胞死亡的一種方式。在正常的心肌組織中，心肌細(xì)胞的凋亡率非常低，但既往研究均證實心肌肥厚的過程中心肌細(xì)胞凋亡率會以幾個數(shù)量級增加[3]。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)在ISO所致的心肌肥厚的過程中，凋亡心肌細(xì)胞數(shù)量增加，同時凋亡蛋白Caspase 3表達(dá)也增加，但這些作用可以被sEH抑制劑TUPs抑制，故提示EET可以通過抑制心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)而改善心肌肥厚。但EET是如何抑制凋亡的仍需作進(jìn)一步探討。有研究證實在缺氧和復(fù)氧的情況下，EET可以降低心肌Caspase 3的活性從而保護(hù)心臟[6]。而這一保護(hù)作用依賴于PI3K信號通路的激活。同樣Dhanasekaran等[7]也證明EET抗凋亡作用可能是通過影響PI3K下游的效應(yīng)分子，例如Akt，Bcl-xl/Bcl-2相關(guān)死亡啟動子BAD和凋亡蛋白Caspase 9和Caspase 3而實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究結(jié)果提示了sEH抑制劑TUPs可以通過抑制ISO所致心肌細(xì)胞的凋亡進(jìn)而改善心肌肥厚，本研究結(jié)果可為心肌肥厚的治療提供新的思路。