腦動(dòng)靜脈畸形直徑與載脂蛋白E啟動(dòng)子基因多態(tài)性相關(guān)性研究

殷 成，何宗澤，何 森

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，四川 成都 610072)

腦動(dòng)靜脈畸形(Cerebral arteriovenous malformation，AVM)為一種起病突然且常導(dǎo)致患者致殘致死的嚴(yán)重腦血管疾病。目前研究發(fā)現(xiàn)AVM的形成可能與胚胎形成、生長(zhǎng)發(fā)育及各種顱內(nèi)疾病等多種因素相關(guān)[1]，但其準(zhǔn)確發(fā)病原因尚未被闡明。人類載脂蛋白E(apolipoprotein E，APOE)俗稱apoE蛋白，腦中apoE含量在人體中位居第二[2]，已有研究證實(shí)APOE參與了多種腦出血相關(guān)疾病的病理過(guò)程[3]。眾所周知某個(gè)基因是否表達(dá)及表達(dá)量取決于特定的啟動(dòng)子啟動(dòng)過(guò)程，APOE基因的表達(dá)同樣受其啟動(dòng)子調(diào)控，目前認(rèn)為在APOE啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性，而以-219 G/T、-427 T/C和-491 A/T最為重要[4，5]，上述啟動(dòng)子區(qū)域可在體內(nèi)通過(guò)各種等位形式調(diào)控APOE基因的表達(dá)量及組織特異性等，因而該區(qū)域的多態(tài)性可能影響中腦血管疾病的發(fā)病與轉(zhuǎn)歸。因此，本研究擬從啟動(dòng)子的基因多態(tài)性這個(gè)全新角度去探索AVM與APOE基因型多態(tài)性形之間的關(guān)系，以求發(fā)現(xiàn)AVM在基因啟動(dòng)子水平可能存在的發(fā)病機(jī)理。

1 資料與方法

1.1一般資料四川省人民醫(yī)院神經(jīng)外科2015年5月至2018年1月收治的AVM住院患者137例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)CTA證實(shí)的腦AVM；②未出血或首次自發(fā)出血的患者：③臨床資料記錄完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①脊髓動(dòng)靜脈畸形；②首次出血后再出血腦AVM患者；③出血后存活不足3天的病例。記錄患者的年齡，患高血壓和高血脂與否等基礎(chǔ)臨床資料，同時(shí)，所有患者均予以相應(yīng)的對(duì)癥支持治療。該研究得到醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，同時(shí)獲得患者本人或家屬(患者意識(shí)障礙)的同意。

1.2腦動(dòng)靜脈畸形描述①AVM大小分級(jí)，參閱Spetzler-Martin分級(jí)法，將CTA圖像所示病變最大直徑為參考標(biāo)準(zhǔn)，分為≤3 cm和>3 cm兩種情況；②依據(jù)畸形血管團(tuán)的引流靜脈情況分為：僅存在腦表淺靜脈引流和有深部靜脈引流兩種類型；③依據(jù)畸形血管團(tuán)是否鄰近腦功能區(qū)(感覺(jué)運(yùn)動(dòng)、語(yǔ)言和視覺(jué)皮層，下丘腦和丘腦，內(nèi)囊，腦干，小腦腳，小腦深部神經(jīng)核)分為：鄰近腦功能區(qū)和不鄰近腦功能區(qū)兩種類型。

1.3APOE啟動(dòng)子基因型的鑒定該流程中患者資料和實(shí)驗(yàn)人員之間為雙盲狀態(tài)。采集患者右側(cè)肘部靜脈血后使用PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)技術(shù)檢測(cè)。先將血液中全DNA抽提出(DNA抽提試劑盒，Takara公司，日本)，使用引物上游5’-CAAGGTCACACAGCTGGCAAC-3’； 下游5’-TCCAATCGACGGCTAGCTACC-3’，擴(kuò)增得到1423bp的PCR產(chǎn)物(命名為TrDNA)。隨后使用引物上游5’-CAGAATGGAGGAGGTGTCCG-3’下游5’-GGAGGTGGGGCATAGAGGTCT-3’擴(kuò)增上述TrDNA，將得到93bp的產(chǎn)物使用MspI內(nèi)切酶(Takara公司，日本)酶切并凝膠電泳分離，-219 G/T分型為：74bp為G等位基因，93bp的為T等位基因。進(jìn)一步使用引物上游5'-TGTTGGCCAGGCTGGTTTTAA-3’，下游5'-CTTCCTTTCCTGACCCTGTCC-3’擴(kuò)增TrDNA，將228bp的產(chǎn)物使用AIu I內(nèi)切酶(Takara公司，日本)和Dra I內(nèi)切酶(Takara公司，日本)酶切并電泳分離。-427 T/C分型：144bp和84bp為T等位基因，228bp為C等位基因；-49lA/T型：228bp為T等位基因，200bp和28bp的為A等位基因。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0軟件。計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，比較采用卡方檢驗(yàn)。危險(xiǎn)因素分析采用Logistic多元回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1APOE啟動(dòng)子基因型分布本組137例AVM患者的基因型中，APOE啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性-219 G/T、-427 T/C、-491 A/T及等位基因頻率見(jiàn)表1，其分布均符合遺傳學(xué)Hardy-Weinberg規(guī)律(P> 0.05)，即該研究樣本為遺傳平衡群體。

表1 APOE啟動(dòng)子基因型分布

2.2APOE啟動(dòng)子多態(tài)性與AVM直徑本研究納入腦AVM患者137例，其中86例患者AVM直徑≤3 cm，51例患者AVM直徑>3 cm，檢測(cè)所有患者的APOE基因啟動(dòng)子的多態(tài)性。結(jié)果提示：①攜帶有啟動(dòng)子-219 G/T或-427 T/C的患者，其AVM直徑>3 cm的發(fā)生率無(wú)明顯不同(P> 0.05)；②130例攜帶有-491 A的患者中，其AVM直徑>3 cm比例為37.12%，其遠(yuǎn)高于27例攜帶有-491 T的患者中5例的AVM直徑>3 cm比例18.52%(P= 0.011)。見(jiàn)表2。

2.3AVM患者相關(guān)臨床資料和AVM直徑在本次納入的全部AVM患者中，平均年齡為31.3歲，男73例，女64例，其中有51例患者AVM直徑>3 cm，而86例患者AVM直徑≤3 cm。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在上述AVM直徑≥73 cm和直徑≤3 cm組中，其指標(biāo)涉及年齡、性別、血壓、血脂、病變是否臨近腦功能區(qū)以及是否深靜脈引流，構(gòu)成上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，見(jiàn)表3。

2.4臨床因素和APOE啟動(dòng)子亞型單與AVM直徑的Logistic回歸分析在進(jìn)行單因素Logistic回歸分析時(shí)，深靜脈引流與AVM直徑存在相關(guān)性，-491 A也與AVM直徑>3 cm存在相關(guān)性，是AVM直徑>3 cm的危險(xiǎn)因素，而其余啟動(dòng)子亞型與AVM直徑>3 cm未表現(xiàn)出相關(guān)性。多因素Logistic回歸分析仍然發(fā)現(xiàn)-491 A是AVM直徑大于3 cm的危險(xiǎn)因素(P= 0.012，OR=1.876，95%CI 0.423～1.709)。

表2 APOE啟動(dòng)子多態(tài)性和AVM直徑的關(guān)系 [n(%)]

表3 137例患者臨床資料與AVM直徑

表4 各因素與AVM的Logistic回歸分析

3 討論

本研究納入137例診斷為AVM的患者，其中有51例患者AVM直徑>3 cm，統(tǒng)計(jì)分析提示攜帶有-491 A的患者AVM直徑>3 cm比例顯著高于攜帶有-491 T的患者，且單因素和多因素的Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)-491 A是AVM直徑>3 cm的危險(xiǎn)因素。

腦動(dòng)靜脈畸形是位于腦實(shí)質(zhì)中的動(dòng)靜脈畸形，其畸形血管團(tuán)位于與有重要功能的腦組織區(qū)域相臨概率高，因?yàn)榇篌w積病變會(huì)對(duì)腦組織造成壓迫效應(yīng)，此外因AVM盜血導(dǎo)致其原供血區(qū)腦組織的慢性缺血，若畸形血管團(tuán)破裂出血?jiǎng)t對(duì)周圍腦組織造成毀滅性后果[6]。目前針對(duì)AVM的治療手段包括開(kāi)顱手術(shù)切除、血管內(nèi)介入栓塞和伽瑪?shù)墩丈渲委煹萚7，8]，而血管畸形病變本身的大小仍是用來(lái)確定治療手段的重要參考指標(biāo)，因此本研究將AVM分為>3 cm和≤3 cm兩個(gè)組別來(lái)進(jìn)行研究。

既往研究發(fā)現(xiàn)很大比例的腦AVM是散發(fā)的，然而，隨后的證據(jù)支持家庭遺傳因素影響了腦AVM的表型，并支持基因的多態(tài)性與該疾病相關(guān)[9]。蛋白質(zhì)表達(dá)和功能也許被生物體內(nèi)普遍存在的基因多態(tài)性精確調(diào)控，并最終導(dǎo)致人類具體疾病相關(guān)外在表型的改變[10]。例如：有研究發(fā)現(xiàn)ALK-1包含的內(nèi)含子多態(tài)性在腦AVM中存在較高的頻率[11]。其它基因或單核苷酸多態(tài)性也影響顱內(nèi)出血[12]、診斷后的顱內(nèi)再出血[13]、以及顱內(nèi)出血后的治療效果[14]等腦AVM的主要臨床過(guò)程。上述研究結(jié)果證實(shí)了腦AVM與基因多態(tài)性存在明顯的聯(lián)系，但與人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)系極為密切的apoE蛋白尚未得到足夠關(guān)注。人類apoE蛋白在腦中的總含量位居各個(gè)器官中第二位[2]。人體中APOE存在三個(gè)等位基因ε2，ε3，ε4，與之相對(duì)應(yīng)則有三個(gè)apoE蛋白亞型apoE 2，apoE 3，和apoE 4，三者相互之間僅有一個(gè)氨基酸位點(diǎn)不同[15]，卻存在截然不同的生物學(xué)效應(yīng)。已有研究證明apoE的不同亞型與腦AVM的臨床表現(xiàn)存在聯(lián)系。Pawlikowska等發(fā)現(xiàn)APOEε2攜帶者的動(dòng)靜脈破裂出血率為非攜帶者的5倍[13]。Achrol等的研究納入了經(jīng)歷了手術(shù)、介入或栓塞治療后AVM的患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶APOEε2的患者其治療后再出血的風(fēng)險(xiǎn)是非攜帶者的3.2倍，而且該風(fēng)險(xiǎn)僅存在于非手術(shù)治療組[14]，上述研究提示腦AVM出血與APOE基因多態(tài)性存在明顯關(guān)聯(lián)，但腦AVM的其他特性與APOE的關(guān)系尚未被報(bào)道，同時(shí)能調(diào)控APOE基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的APOE基因啟動(dòng)子[16]在腦AVM中扮演的角色則從未曾揭示。而在本研究中，則開(kāi)拓性地探究了APOE基因啟動(dòng)子多態(tài)性和腦AVM之間的關(guān)系。

ApoE為載脂蛋白，通過(guò)與其受體結(jié)合而在細(xì)胞及組織間轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)為其基本功能，而人體動(dòng)靜脈血管作為運(yùn)送血液的機(jī)械管道則主要由內(nèi)皮細(xì)胞、纖維蛋白等組成，二者之間表面上似乎不存在聯(lián)系，但本研究卻發(fā)現(xiàn)腦AVM和患者攜帶有APOE啟動(dòng)子-491 A相關(guān)，該結(jié)果可能有如下兩點(diǎn)潛在意義。首先，腦AVM的發(fā)生有可能與顱內(nèi)的脂質(zhì)代謝相關(guān)。在成年人群中，脂質(zhì)和血管相關(guān)性疾病已被廣泛關(guān)注，尤其是導(dǎo)致多個(gè)臟器病變的動(dòng)脈粥樣硬化；而在胚胎時(shí)期，也有研究提示脂質(zhì)與顱內(nèi)血管發(fā)育相關(guān)，Harland等報(bào)道在小雞胚胎發(fā)育過(guò)程中，作為脂質(zhì)的前列腺素影響了大血管直徑[17]，因此推測(cè)apoE與腦AVM形成過(guò)程存在關(guān)聯(lián)。其次，載脂蛋白apoE在腦AVM的發(fā)生過(guò)程中，很可能不僅僅扮演了其搬運(yùn)脂質(zhì)的作用，而更可能參與了腦AVM發(fā)生過(guò)程中的分子信號(hào)通路調(diào)節(jié)。基于腦AVM可能為先天發(fā)育異常，而個(gè)體基因在受精卵時(shí)期已定型，因此APOE啟動(dòng)子有可能在胚胎發(fā)育期間即開(kāi)始扮演其負(fù)面角色，通過(guò)影響apoE進(jìn)而干預(yù)信號(hào)通路調(diào)節(jié)。

綜上所述，本研究盡管首次揭示了在分子層面的APOE啟動(dòng)子與腦AVM大小的關(guān)系，但APOE啟動(dòng)子如何在AVM的病理生理過(guò)程中發(fā)揮作用以及其可能的分子調(diào)控機(jī)制仍有待于闡明，以期繼而能助于腦AVM的預(yù)防和治療。