上皮性卵巢癌中MRP1、BCRP、BRCA1基因的表達(dá)及其意義

楊 軍，彭 梅

(1.四川省涼山彝族自治州第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 西昌 615000；2.四川大學(xué)華西廣安醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 廣安 638000)

卵巢癌是女性常見的三大惡性腫瘤之一，由于臨床癥狀不明顯，發(fā)病較為隱匿，大部分患者來院就診時已屬晚期[1]。臨床資料表明，上皮性卵巢癌的發(fā)病率約占卵巢癌總發(fā)病數(shù)的90%[2]。目前臨床對于上皮性卵巢癌的治療多采用手術(shù)聯(lián)合化療的方案，但近年來發(fā)現(xiàn)，約有25%的卵巢癌患者對化療藥物存在原發(fā)耐藥，60%以上的患者存在繼發(fā)性耐藥[3]。盡管近年來卵巢癌患者通過化療5年生存率已有所提高，但由于化療耐藥的存在導(dǎo)致5年生存率只有20%[4]。因此，對上皮性卵巢癌化療耐藥的機(jī)制進(jìn)行探討，為上皮性卵巢癌的化療用藥提供指導(dǎo)是當(dāng)前研究較為熱門的課題。研究表明，多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、乳腺癌易患基因1(breast cancer 1，early onset，BRCA1)可能與上皮性卵巢癌的化療耐藥及預(yù)后相關(guān)[5～7]，本研究對MRP1、BCRP、BRCA1在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及其意義進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1一般資料2013年3月至2016年5月在我院實(shí)施手術(shù)治療的47例上皮性卵巢癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)[8]:①經(jīng)病理檢查確診為上皮性卵巢癌；②術(shù)前未進(jìn)行過化療，術(shù)后實(shí)施以順鉑為基礎(chǔ)的化療6個療程。年齡25～68歲[(49.3±4.2)歲]。根據(jù)耐藥情況分為兩組，其中耐藥組22例，年齡25～67歲[(48.7±3.5)歲]；敏感組25例，年齡26～68歲[(49.1±3.2)歲]。另選20例正常卵巢組織標(biāo)本作為對照組，標(biāo)本來自子宮肌瘤實(shí)施子宮和附件切除手術(shù)并經(jīng)病理檢查確定卵巢組織正常者，年齡25～66歲[(48.8±3.1)歲]。三組研究對象的基礎(chǔ)資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均知情同意并自愿簽署同意書。

1.2材料與試劑Trizol試劑(美國Invitrogen公司，批號:15596026)、氯仿(北京化學(xué)試劑廠，批號:1041191)，異丙醇(北京化學(xué)試劑廠，批號:GF0516)、乙醇(北京化學(xué)試劑廠，批號:GF0498)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司，批號:A3500)、實(shí)時熒光定量PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司，批號:A5003)、實(shí)時熒光定量PCR引物(美國Invitrogen公司，批號:F02001)、0.1%二乙基焦磷酰胺水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

1.3方法采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對上皮性卵巢癌組織和正常卵巢組織中MRP1、BCRP、BRCA1基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測:①無菌條件下用剪刀獲取組織并置于液氮盒內(nèi)，凍存于-80 ℃冰箱；②經(jīng)研磨勻漿、分層、RNA洗滌、沉淀及RNA溶解保存提取組織總RNA；③采用核酸定量對組織總RNA的濃度和純度進(jìn)行測定；④RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA、目的基因擴(kuò)增，分兩步完成對MRP1、BCRP、BRCA1基因的測定。

1.4化療耐藥的判定化療療效通過盆腔和腹部檢查、糖類抗原125水平，并結(jié)合超聲、CT或二次探查術(shù)所見評價。當(dāng)初次化療后未出現(xiàn)臨床證實(shí)的緩解(即臨床癥狀仍存在，盆腔或超聲檢查仍有包塊，血清糖類抗原125未下降至正常水平)或在化療后6個月內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)即可判定為耐藥。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MRP1、BCRP、BRCA1表達(dá)的比較MRP1和BCRP在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)量與表達(dá)率均高于正常卵巢組織(P< 0.05)。BRCA1在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)量和表達(dá)率與正常卵巢組織比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。見表1、2，圖1。

2.2MRP1、BCRP、BRCA1在上皮性卵巢癌耐藥組與敏感組中的表達(dá)情況耐藥組MRP1、BCRP及BRCA1的表達(dá)量和表達(dá)率均高于敏感組(P< 0.05)。見表3、4，圖2。

表1 上皮性卵巢癌組織與正常卵巢組織中MRP1、BCRP、BRCA1相對表達(dá)量比較

圖1 兩組MRP1、BCRP、BRCA1 mRNA電泳結(jié)果(1～3為上皮性卵巢癌組織；4～6為正常卵巢組織)

表2 上皮性卵巢癌組織與正常卵巢組織中MRP1、BCRP、BRCA1表達(dá)率比較 [n(%)]

表3 MRP1、BCRP、BRCA1在上皮性卵巢癌耐藥組與敏感組的相對表達(dá)量

表4 MRP1、BCRP、BRCA1在上皮性卵巢癌耐藥組與敏感組的表達(dá)率比較 [n(%)]

圖2 兩組MRP1、BCRP、BRCA1 mRNA電泳結(jié)果(1～3為耐藥組；4～6為敏感組)

3 討論

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，也是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。盡管臨床上通常采用手術(shù)治療，但術(shù)后化療仍然是治療的重要手段。卵巢癌患者的預(yù)后情況直接取決于其對化療的反應(yīng)，近年來隨著各類化療藥物和技術(shù)的應(yīng)用，卵巢癌患者初始化療反應(yīng)率可達(dá)80%，但由于耐藥的存在，卵巢癌患者的5年生存率仍然較低，只有30%[9，10]?；熌退幠壳耙殉蔀橛绊懧殉舶┗颊哳A(yù)后的重要因素[11]，研究發(fā)現(xiàn)[12]，20%～30%的上皮性卵巢癌患者為原發(fā)鉑類耐藥，80%的患者在治療過程中出現(xiàn)耐藥。腫瘤細(xì)胞對化療耐藥是多方面的，包括:①增強(qiáng)DNA損傷的耐受性與損傷后的自我修復(fù)[13]；②增強(qiáng)藥物的外排，減少藥物在細(xì)胞內(nèi)的積聚；③促進(jìn)藥物失活。耐藥基因的異常表達(dá)是腫瘤耐藥的一個重要方面，基于此，近年來很多醫(yī)院將卵巢癌耐藥基因的表達(dá)作為監(jiān)測、評估患者預(yù)后的重要指標(biāo)[14]。MRP1、BCRP和BRCA1是臨床已經(jīng)證實(shí)的與化療耐藥相關(guān)的基因[15～17]，而關(guān)于其在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及其與耐藥的關(guān)系尚未見相關(guān)報道，本研究就此進(jìn)行探討。

MRP1蛋白是一種多藥耐藥相關(guān)蛋白，與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，屬于ATP-結(jié)合盒超家族成員，其主要功能是將細(xì)胞內(nèi)帶負(fù)電荷的分子排出胞外?；熕幬镌诩?xì)胞內(nèi)被代謝成帶負(fù)電荷的離子，從而被MRP1蛋白轉(zhuǎn)移至胞外，進(jìn)而無法發(fā)揮作用。這是MRP1介導(dǎo)的化療耐藥的主要作用途徑。MRP1蛋白的高表達(dá)可導(dǎo)致非P-糖蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥。本研究表明，MRP1在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)量和表達(dá)率均較正常卵巢組織升高，這與黃好亮等[18]和陳亮等[19]的研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，耐藥組患者M(jìn)RP1的表達(dá)量和表達(dá)率均顯著高于敏感組，其機(jī)制可能是順鉑類化療藥物能夠誘導(dǎo)上皮性卵巢癌組織過量表達(dá)MRP1，而過量MRP1能提高轉(zhuǎn)運(yùn)負(fù)電荷藥物能力，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，進(jìn)而降低臨床療效，可能提高患者耐藥性。

BCRP屬于ATP-結(jié)合盒膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員。BCRP可介導(dǎo)上皮性卵巢癌的耐藥，但相對于金屬蛋白酶、P-糖蛋白等ATP-結(jié)合盒膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的其他成員，BCRP介導(dǎo)的是非典型耐藥，隨著BCRP表達(dá)的增高，BCRP細(xì)胞對甲氨蝶呤、吡柔比星、米托蒽醌、5-氟尿嘧啶、多柔比星、依托泊苷等抗癌藥的耐藥指數(shù)增加，但其在人體正常的作用尚不明確[20]。本研究顯示，BCRP在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)量、表達(dá)率均低于正常卵巢組織，其中耐藥組中的表達(dá)率也低于敏感組，這可能是由于BCRP在化療生存中有一定的保護(hù)作用，而目前卵巢癌組織中的BCRP的研究甚少，BCRA是否能預(yù)測化療藥物耐藥敏感仍是熱點(diǎn)問題。

本研究顯示，BRCA1在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)量和表達(dá)率與正常卵巢組織相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。與吳氫凱等[21]的研究結(jié)果一致。此外，耐藥組患者BRCA1的表達(dá)量和表達(dá)率均明顯高于敏感組，說明BRCA1的高表達(dá)會抑制化療藥物功能的發(fā)揮，其原因可能是因?yàn)锽RCA1能夠增強(qiáng)細(xì)胞的修復(fù)能力，從而使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性而不易被化療藥物殺死。

綜上所述，MRP1，BCRP在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)量會顯著增加，BRCA1表達(dá)量變化不顯著。三種基因表達(dá)量增加均與化療耐藥的產(chǎn)生有關(guān)。