毛細(xì)管氣相色譜法測定吉非替尼原料藥中殘留有機(jī)溶劑

鄭榮杰

(廣東省第二人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510317)

吉非替尼化學(xué)名為N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉-4-丙氧基)喹唑啉-4-胺，又名易瑞沙，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。由阿斯利康制藥有限公司研制，2003年在美國上市，該藥是一種口服的、選擇性的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，其作用機(jī)制是阻斷腫瘤細(xì)胞增殖、存活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和其他促進(jìn)癌細(xì)胞擴(kuò)散的相關(guān)過程[1]。在吉非替尼的合成和精制過程中由于使用了甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，因此在制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)必須考察該原料藥中有機(jī)溶劑的殘留問題[2-5]。根據(jù)《中國藥典》和人用藥品注冊(cè)技術(shù)規(guī)范國際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)關(guān)于藥品中有機(jī)溶劑殘留量測定的指導(dǎo)原則，二氯甲烷屬于避免溶劑，質(zhì)量濃度限量為5mg·L-1，甲醇屬于限制溶劑，質(zhì)量濃度限量為5000mg·L-1，乙醇、丙酮和乙酸乙酯屬于低潛在毒性溶劑，質(zhì)量濃度限量小于5mg·L-1[6-7]。本文采用毛細(xì)管氣相色譜法[8-12]同時(shí)對(duì)甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯5種殘留溶劑進(jìn)行檢測[13-21]，操作簡便、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為進(jìn)一步研究吉非替尼質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的可行方法。

圖1吉非替尼結(jié)構(gòu)

Fig.1 Structure of gefitinib

1 儀器與試藥

1.1儀器 GC-2010氣相色譜儀，包括SHMADZU AOC-20i 自動(dòng)進(jìn)樣器，AUY120分析天平(日本島津公司)。

1.2試藥 吉非替尼(批號(hào)：201402001，201402002，201402003，201404001，201404002，201404003)由廣東藥科大學(xué)藥物化學(xué)系提供。二甲基亞砜(GC級(jí))，甲醇(色譜純)，德國默克公司；乙醇、乙酸乙酯(GC級(jí))，阿拉丁試劑有限公司；丙酮(GC級(jí))，二氯甲烷(分析純)，廣州化學(xué)試劑廠。實(shí)驗(yàn)用水為超純水；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：采用石英毛細(xì)管柱Rtx-624(60 mm×0.32 mm，1.8 μm)；柱溫：60 ℃，以5 ℃·min-1的速率升溫至80 ℃，保持2 min，以100 ℃·min-1的速率升溫至200 ℃，保持4 min；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度：250 ℃；載氣：氮?dú)?；流速?.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：1.0 μL。

2.2溶液的配制 空白溶液：精密量取DMSO 3 mL，置于頂空進(jìn)樣瓶中，作為空白溶液。

混合對(duì)照品溶液：取甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯對(duì)照品適量，用DMSO溶解配制成含甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯質(zhì)量濃度分別為3，4.96，4.96，0.64和4.96 mg·mL-1的溶液作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置于同一10 mL量瓶中，用DMSO稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取本品1 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，用DMSO稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.3系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯適量，加DMSO溶解，稀釋成質(zhì)量濃度分別為120.2，198.4，198.7，25.44和198.8 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各1 μL，分別進(jìn)樣，各連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果混合對(duì)照品溶液中甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯與DMSO分離良好，空白溶劑無干擾，見圖2和表1。

圖2GC圖

A.空白溶劑；B.混合對(duì)照品溶液；C.供試品溶液；1.甲醇；2.乙醇；3.丙酮；4.二氯甲烷；5.乙酸乙酯。

Fig.2 GC chomatograms

A.blank solvent；B.mixed reference solution；C.sample solution；1.methanol；2.ethanol；3.acetone；4.dichloromethane；5.ethyl acetate.

2.4檢測限、定量限實(shí)驗(yàn) 取各溶劑適量,用DMSO逐級(jí)稀釋至S/N=10時(shí)的質(zhì)量濃度為其定量限，稀釋至S/N=3時(shí)的質(zhì)量濃度為其檢測限，結(jié)果甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯的檢測限分別為0.379 7,0.379 2,0.215 2,0.826 8和0.288 6 μg·mL-1；定量限分別為0.795 4,0.758 5,0.430 1,1.653 0和0.577 1 μg·mL-1。

2.5線性關(guān)系考察 分別精密量取2.2項(xiàng)下制備的對(duì)照品儲(chǔ)備液0.4，0.8，1.0，1.2，1.5和2.0 mL，置于25 mL量瓶中，用DMSO稀釋至刻度，搖勻。取上述溶液各3 mL，置于頂空進(jìn)樣瓶中，按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，進(jìn)行線性回歸，其線性關(guān)系見表2。

表1系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 The test results of the system test

溶劑甲醇乙醇丙酮二氯甲烷乙酸乙酯峰面積149 888.0419 521.1446 856.913 585.1332 141.0148 033.1412 162.5428 362.213 862.3327 029.2144 886.2404 377.2429 036.113 493.7327 959.5144 066.5402 746.0426 995.413 973.9326 741.0147 408.9413 151.3438 152.614 009.2335 015.3平均峰面積146 856.54410 391.62433 880.6413 784.84329 777.2RSD/%0.20.20.20.20.1理論塔板數(shù)8 915.512 395.282 114.58 825.415 774.7

2.6精密度實(shí)驗(yàn)

2.6.1方法精密度 稱取吉非替尼供試品適量，配制成質(zhì)量濃度為40 mg·mL-1的6份吉非替尼供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測定，樣品中的殘留溶劑甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯的RSD值分別為0%，0%，1.8%，0%和0%，結(jié)果表明，該方法精密度良好。

表25種殘留溶劑的線性方程及范圍

Tab.2 Linear relationships and ranges of the 5 residual solvents

溶劑質(zhì)量濃度范圍/μg·mL-1線性關(guān)系r甲醇48.08^240.4y=1 300 000x-251.300.999 1乙醇79.39^396.8y=750 000x-284.840.999 4丙酮79.48^397.4y=2 300 000x-349.300.999 6二氯甲烷10.18^50.88y=530 000x+125.010.999 2乙酸乙酯79.48^397.4y=2 200 000x+306.230.999 1

2.6.2中間精密度 分別配制6份質(zhì)量濃度為40 mg·mL-1的吉非替尼供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測定，樣品中的殘留溶劑甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯的RSD值分別為0%，0%，1.4%，0%和0%，結(jié)果表明，中間精密度良好。

2.7耐用性實(shí)驗(yàn) 改變氣相色譜條件中的起始溫度(±10 ℃)和流速(±0.2 mL·min-1)，各溶劑峰的分離度均大于2.0%，結(jié)果表明，該方法耐用性良好。

2.8回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取供試品0.4 g，共10份，置于10 mL量瓶中，其中1份加10 mL DMSO，作為空白溶液，其余9份均分成3組，分別加入2.3項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液0.5，1.0和1.5 mL，加DMSO定容至刻度，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算回收率，結(jié)果均符合要求，見表3。

表35種有機(jī)溶劑的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.3 Results of recovery tests of the 5 residual solvents(n=3)

溶劑 回收率/%80%溶液100%溶液120%溶液平均回收率/%RSD/%甲醇97.298.498.197.90.64乙醇100.4100.499.8100.20.35丙酮98.398.399.598.70.71二氯乙烷102.9100.3100.4101.21.46乙酸乙酯101.597.1101.6100.12.57

2.9樣品中有機(jī)溶劑殘留量的測定 取吉非替尼樣品6批，用DMSO配制成質(zhì)量濃度為40 mg·mL-1的供試品溶液，另取甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯對(duì)照品，配制成質(zhì)量濃度分別120.2，198.4，198.7，25.44和198.8 μg· mL-1的混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測定，采用峰面積外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算，批號(hào)201402001，201402002，201402003，201404001，201404002和201404003的樣品中丙酮?dú)埩艉糠謩e為0.935 4,1.215 4,1.315 4,0.894 1,1.298 9和1.529 0；各批號(hào)均未檢出甲醇、乙醇、二氯甲烷和乙酸乙酯。6批樣品中殘留溶劑的含量均小于混合溶劑對(duì)照品的量(限量)，產(chǎn)品符合要求。

3 討論

本文通過對(duì)色譜柱和柱溫進(jìn)行考察，結(jié)果表明，采用中性色譜柱Rtx-624，起始溫度60 ℃，維持8 min，以5 ℃·min-1上升至80 ℃，維持2 min，以100 ℃· min-1上升至200 ℃，維持4 min，進(jìn)樣口溫度200 ℃，流速3.0 mL·min-1，在此氣相色譜條件對(duì)該5種溶劑進(jìn)行測定，各溶劑峰分離度大于2.0，方法耐用性良好。在限量40%～200%范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，線性系數(shù)大于0.999 1，其準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)回收率的RSD值為97.9%～101.2%，方法準(zhǔn)確度良好。由于本方法采用丙酮干燥，因此，在吉非替尼樣品中存在少量丙酮，其含量低于限量，樣品合格。

《中國藥典》規(guī)定，甲醇和二氯甲烷屬于第二類溶劑，其限度分別為0.3%和0.066%，乙醇、丙酮和乙酸乙酯屬于第三類溶劑，其限度均為0.5%。本實(shí)驗(yàn)采用峰面積外標(biāo)法對(duì)吉非替尼樣品中的殘留溶劑進(jìn)行測定，要求吉非替尼樣品中各溶劑殘留的峰面積均小于溶劑對(duì)照品的峰面積。

經(jīng)過上述驗(yàn)證，表明本文建立的方法線性、精密度、回收率、定量限、檢測限以及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果均較好，能夠準(zhǔn)確、迅速地檢測出吉非替尼原料藥中殘留的甲醇、乙醇、丙酮、二氯乙烷和乙酸乙酯，從而保證用藥的安全性。