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    荷斯坦牛BoLA-DRA基因外顯子1生物信息學(xué)分析

    2018-07-19 01:22:42付保強虎紅紅劉麗霞
    現(xiàn)代畜牧獸醫(yī) 2018年6期
    關(guān)鍵詞:荷斯坦外顯子多態(tài)性

    付保強,虎紅紅,劉麗霞

    (西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州 730030)

    主要組織相容性復(fù)合體(Major Histocompatibility Complex,MHC)是動物機體中緊密連鎖的不平衡的基因復(fù)合體[1],其在機體免疫應(yīng)答、抗原識別和機體調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[2],編碼產(chǎn)物為MHC抗原分子,與動物機體免疫疾病存在緊密聯(lián)系性[3-6]。Acosta-Rodrguez等[7]于2005年報道了牛MHC并將其命名為牛白細胞抗原系統(tǒng)(Bovine lymphocyte antigen,BoLA)。荷斯坦牛BoLA基因位于牛的23號染色體上,主要是由三類基因組成,分別為Ⅰ類分子、Ⅱ類分子和Ⅲ類分子,其中Ⅱ類分子主要為異源雙體膜糖蛋白,其被劃分為Ⅱa、Ⅱb兩個亞區(qū),DRA是Ⅱ類分子Ⅱa亞區(qū)的基因,為MHC分子進行編碼,具有高度多態(tài)性[8-11]。由于荷斯坦牛BoLA-DRA能夠引起抗原抗體反應(yīng)降低牛乳房炎等免疫疾病的發(fā)生,使其成為了荷斯坦牛抗病力的良好分子候選基因之一。近年來,研究者對荷斯坦牛BoLA基因的功能、多態(tài)性及其與免疫功能和疾病的相關(guān)性做了大量研究,高樹新(2005)[12]通過對不同牛BoLA基因研究發(fā)現(xiàn)其具有高度多態(tài)性且對奶牛乳房炎具有致病性。王興平(2004)[13]通過對四種黃牛為研究采用PCR-RFLP和SSCP方法,結(jié)合克隆測序分別研究了MHC的DRA基因第二外顯子和DRB3基因第二外顯子的分子遺傳變異,并運用最小二乘線性模型,對所發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點與牛的生產(chǎn)性狀進行了相關(guān)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與牛的生產(chǎn)性能高度相關(guān)。楚秋霞等(2013)[14]通過運用生物信息學(xué)對南陽牛BoLA-DRA編碼蛋白區(qū)的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DRA基因與其他物種核苷酸序列的同源性均在90%以上,進一步表明該基因與疾病性狀存在相互作用關(guān)系。李彥清等(2015)[15]在對牦牛和普通牛BoLA-DRA*Exon2-intron2多態(tài)性分析比較后發(fā)現(xiàn)牦牛DRA基因第2外顯子區(qū)堿基序列與普通牛以及山羊的同源性最高,系統(tǒng)進化情況與它們親緣關(guān)系遠近一致。這些研究都表明BoLA-DRA基因在控制機體免疫調(diào)控方面具有重要作用,但是前人對BoLA-DRA基因大多數(shù)研究主要集中在外顯子2以及其他內(nèi)含子,但是對于荷斯坦牛BoLA-DRA基因中1~93位的外顯子1生物信息學(xué)研究未見報道。

    本研究以荷斯坦牛為研究對象,通過構(gòu)建DNA混合池,擴增后對其進行測序的方法對荷斯坦牛Bo-LA-DRA基因外顯子1進行生物信息學(xué)分析,旨在為研究該基因理化特性、結(jié)構(gòu)功能、免疫調(diào)節(jié)機制提供必要的理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 樣品采集和DNA混合池的構(gòu)建本研究血樣采自寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司,從300頭處于泌乳期荷斯坦牛中用醫(yī)用采血管尾靜脈采血10 mL,利用傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法荷斯坦牛血液總基因組DNA[16],-20℃保存?zhèn)溆?。?%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取效果,隨機抽取30個效果良好的樣品各取1 μL構(gòu)建DNA混合池。

    1.2 引物設(shè)計和PCR擴增測序根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中荷斯坦牛BoLA-DRA基因序列(GenBank:M30120.1),利用在線軟件Primer-BLAST對荷斯坦牛BoLA-DRA基因外顯子1設(shè)計1對的特異性引物,在BoLA-DRA基因中處在1~93位的外顯子1預(yù)期擴增片段長度為161 bp,引物序列分別為:F1:5'-CACCAAAGAAGAAAA TGGCC-3',R1:5-CCACAGTTCATTTCTCCGAAGC-3'上引物序列設(shè)計好后送至蘇州金唯智生物科技有限公司完成。PCR擴增體系20 mL:DNA模板0.8 μL,上、下游引物各0.4 μL,2×Power Taq PCR Master Mix 11 μL,ddH2O 7.4 μL。PCR條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,57.6℃退火30 s,72℃延伸40 s,共30個循環(huán);72℃延伸10 min,4℃保存,擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行檢測,紫外分光光度計檢測。將擴增產(chǎn)物進行回收純化后,送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行PCR產(chǎn)物測序。

    1.3 生物信息學(xué)分析軟件通過對荷斯坦牛BoLADRA基因外顯子1擴增產(chǎn)物的序列測序,運用RNA fold web server在線服務(wù)器(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)預(yù)測mRNA二級結(jié)構(gòu),運用軟件(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sop ma.html)預(yù)測蛋白質(zhì)的二級,利用Protfun在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)分析預(yù)測蛋白質(zhì)的功能。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PCR擴增結(jié)果荷斯坦?;駼oLA-DRA外顯子1 PCR擴增產(chǎn)物片段大小在160 bp左右,預(yù)期目的片段長度大小相符,且條帶明亮清晰、特異性良好,如圖1所示。2

    圖1 荷斯坦?;駼oLA-DRA外顯子1 PCR擴增結(jié)果Fig.1PCR amplification Results of BoLA-DRA exon 1 in Holstein gene

    2.2 測序結(jié)果分析通過對荷斯坦牛DRA外顯子1基因進行測序分析發(fā)現(xiàn),存在1個插入位點(exon1-1T^2)測序峰圖如圖2和3所示。

    圖2 荷斯坦牛DRA基因外顯子1測序峰圖Fig.2The sequence peak diagram of exon 1 of DRA gene

    2.3 mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果通過運用在線軟件對荷斯坦牛DRA外顯子1插入位點mRNA二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測,結(jié)果如圖4所示,發(fā)現(xiàn)外顯子1堿基插入之后自由能與突變前相同,該插入沒有改變DRA外顯子1mRNA的二級結(jié)構(gòu)如圖4所示。

    圖3 測序結(jié)果序列與基因庫序列比較圖Fig.3 Comparison chart of sequencing result sequence and gene pool sequence

    圖4 荷斯坦牛DRA基因外顯子1 mRNA二級結(jié)構(gòu)圖Fig.4 Exon 1 mRNA secondary structure of the DRA gene in Holstein

    2.4 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測荷斯坦牛DRA外顯子1的插位點為錯義突變,因為外顯子1在DRA基因序列的1~93位,但編碼區(qū)只有15~93位點,插入位點不在編碼區(qū)上,未造成氨基酸改變,突變前后蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相同,同時也不會影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能。預(yù)測結(jié)果顯示,荷斯坦牛DRA外顯子1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋(30.77%)、β-折疊(34.62%)、β-轉(zhuǎn)角(11.54%)、無規(guī)則卷曲(23.08%)組成,其中β-折疊占比例最高。

    2.5 蛋白質(zhì)的功能預(yù)測與分析荷斯坦牛DRA外顯子1從預(yù)測結(jié)果可以看出編碼蛋白質(zhì)的荷爾蒙和免疫應(yīng)答的含量相對較高,其幾率分別為21.057和3.546,荷爾蒙的幾率最高,免疫應(yīng)答次之,據(jù)此可以推斷荷斯坦牛DRA基因外顯子1在牛的性激素和免疫應(yīng)答過程中起著重要的作用。

    3 討論

    MHC基因是指脊椎動物某一染色體上編碼主要組織相容性抗原、控制細胞間相互識別、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的一組連鎖的基因群,其具有高度多態(tài)性,與動物自身免疫疾病存在密切關(guān)系BoLA-DRA基因是奶牛MHC基因中的一個編碼基因,目前國內(nèi)對于BoLA-DRA基因的研究主要集中在DRA基因的多態(tài)性上分析上,蒲蘭屏等(2012)[17]通過運用生物信息學(xué)對比不同牛的基因,發(fā)現(xiàn)與MHC家族其他基因不同DRA基因在所有的動物尤其是反芻動物中表現(xiàn)出高度保守,包括肽結(jié)合部位(PBS)、N-糖原區(qū)、α1、α2區(qū)等功能部位都呈現(xiàn)出高度保守。高樹新等(2008)[18]發(fā)現(xiàn)兩種兼用型在研究DRA外顯子2時發(fā)現(xiàn)在感染乳房炎牛中CC基因型頻率最高,在健康牛中BC基因型頻率最高,結(jié)果表明牛乳房炎抗性和易感性可能與牛的基因型有密切關(guān)系。前人對于外顯子1的研究還未見報道,本研究主要對荷斯坦牛BoLA-DRA外顯子1的擴增產(chǎn)物經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)在第一位堿基C和第二位堿基A之間有堿基T的插入,但是沒有影響mRNA的二級結(jié)構(gòu)的變化,并且在發(fā)生突變前后自由能的大小相同,出現(xiàn)的原因可能是因為此堿基的插入為錯義突變,但因為插入位點不在編碼區(qū),不會引起氨基酸結(jié)構(gòu)功能以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的變化,所以對于荷斯坦牛BoLA-DRA基因外顯子1高級結(jié)構(gòu)和功能未發(fā)生變化。功能預(yù)測結(jié)果表明,該基因可能在荷爾蒙的產(chǎn)生和免疫應(yīng)答過程中起著重要的作用,研究結(jié)果可為荷斯坦牛BoLA-DRA基因外顯子1功能的研究提供科學(xué)理論依據(jù)。

    表1 荷斯坦牛DRA基因外顯子1蛋白質(zhì)的功能預(yù)測與分析Table 1 Functional prediction and analysis of exon 1 protein in Holstein DRA

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