黑豆皮花色苷的中壓液相色譜制備及結(jié)構(gòu)鑒定

李旭升，蔣鑫煒，單曉煜，冉國敬，孫建霞，白衛(wèi)濱*

1(暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州，510632) 2(廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州，510090)

花色苷作為一種類黃酮化合物，被當(dāng)作天然著色劑廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)[1]。同時，由于其抗氧化活性，花色苷也被公認(rèn)為是可以促進(jìn)健康的功能性食品成分[2-5]。此外，它還具有抗腫瘤[6]、降血糖[7]、抗炎[8]、保護(hù)皮膚光損傷[9]、保護(hù)生殖損傷[10]等多種功能活性，已被應(yīng)用于治療多種心血管疾病中[10-11]。

黑豆(black soybean)是豆科植物大豆的黑色種子，是藥食兼用的傳統(tǒng)農(nóng)作物[12]。黑豆皮(也稱黑豆衣或烏豆衣)作為黑豆的種皮，富含維生素、鐵、硒等微量元素，在中醫(yī)學(xué)上被稱為功能性食物[13-14]。與此同時，黑豆皮中含有豐富的天然食用色素，其黑色素沉著主要是由于種皮表皮的花色苷積累所致。黑豆皮花色苷最主要成分為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷[12, 15]。由于黑豆皮原料分布廣泛，價格相對低廉，符合工業(yè)化提取、生產(chǎn)花色苷單體的需求。

目前，工業(yè)生產(chǎn)過程中花色苷提取仍以溶劑法為主，一般浸提出的花色苷產(chǎn)品雜質(zhì)多，但其具有成本低廉，操作簡便，易于大量提取等優(yōu)點。浸提后的花色苷粗品經(jīng)過大孔樹脂法粗分離后，需再經(jīng)過半制備高效液相法、超濾法、高速逆流色譜法等[16-17]進(jìn)一步純化后才能得到質(zhì)量較高的產(chǎn)品，但這些方法往往成本昂貴，單次制備量少、生產(chǎn)效率較低，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。中壓制備液相色譜是一種快速制備色譜系統(tǒng)，其具有上樣量大、柱效高、分離速度快、分離效果好、分辨率高等特點[18-19]，經(jīng)中壓制備液相色譜分離后的花色苷可以進(jìn)一步做單一組分的研究。故本實驗通過乙醇浸提法對黑豆皮中的花色苷進(jìn)行粗提，采用大孔吸附樹脂進(jìn)行初步純化，然后利用中壓制備色譜對粗提物進(jìn)行分離，再利用質(zhì)譜分析技術(shù)對其花色苷進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆皮，來源于安徽亳州；Amberlite XAD-7HP 大孔吸附樹脂，美國Rohmand Haas；0.25～0.45 μm C18填料，日本富士；甲醇(HPLC)，上海安普；甲酸(HPLC)、三氟乙酸(HPLC)，美國Sigma；其余試劑乙醇、石油醚、HCl、甲醇、甲酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LS5紫外可見分光光度計、 PHS-3C精密pH計，上海儀電分析儀器有限公司；RE-52AAA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海嘉鵬科技有限公司；SCIENTZ-12N 真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；EZ PLUS 2000中壓制備液相色譜(配有二元溶劑輸送泵、UV檢測器、自動收集器)，利穗科技有限公司；E2695分析型高效液相色譜儀(色譜柱：Venusil ASB-C18，5 μm，4.6 nm×250 nm)，美國Waters公司； LC-MS 8045質(zhì)譜分析儀，日本島津。

1.3 實驗方法

1.3.1 黑豆皮花色苷粗提物的制備

準(zhǔn)確稱取1.5 kg黑豆皮粉末，加入15 L體積分?jǐn)?shù)65%的酸化乙醇(0.1%三氟乙酸酸化)充分?jǐn)嚢韬?，? ℃避光浸提8 h，采用布氏漏斗抽濾收集提取液，剩余黑豆皮渣再次用酸化乙醇浸提2次，合并3次提取液。提取液于42 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無醇味后，加入1/3體積石油醚萃取，充分混合后靜置過夜，收集下層水相，重復(fù)操作2～3次直至萃取完全。下層水相收集液于35℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮除盡石油醚，待上柱。大孔吸附樹脂柱預(yù)先用2倍柱體積(BV)的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇以1 BV/h 流速活化并浸泡6 h，再用2 BV體積分?jǐn)?shù)2%的HCl溶液酸洗并浸泡3 h，水洗至中性后再用2 BV體積分?jǐn)?shù)2% NaOH溶液堿洗并浸泡3 h，再用去離子水洗至中性。以2 BV的體積分?jǐn)?shù)0.1%的HCl清洗柱子直至柱子上層液體與流出液pH值相同。緩慢加入待上柱液體，待吸附后用2 BV的0.1% HCl溶液以1 BV/h 流速清洗后，用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇洗脫。收集洗脫液，于42 ℃減壓濃縮至無醇味，冷凍干燥48 h得花色苷粗提品。

1.3.2 總花色苷含量的測定

分別精確稱取0.1 g黑豆皮花色苷粗提品，用pH=1.0的KCl-HCl緩沖液和pH=4.5的CH3COONa-HCl緩沖溶液定容到100 mL，于400～800 nm波長內(nèi)進(jìn)行可見光掃描，以確定黑豆皮花色苷的最大吸收波長。在最大吸收波長下，對樣品按時間掃描以確定平衡時間。在達(dá)到平衡時間后，在最大吸收波長下測定吸光值，按公式(1)[20]計算黑豆皮花色苷粗提品的花色苷總含量。

式中：X為樣品中花色苷含量，mg/g；ε為矢車菊-3-O-葡萄糖苷消光系數(shù)，26 900，L/(mol·cm)；L為比色皿光程，1 cm；Mw為矢車菊-3-葡萄糖苷摩爾質(zhì)量，449.2，g/mol；DF為稀釋倍數(shù)；V為待測樣品最終體積，mL；mt為取樣質(zhì)量，g；A=(Aλvis-max-A700)pH 1.0-(Aλvis-max-A700)pH 4.5，λvis-max為可見光區(qū)最大吸收波長。

分別取黑豆皮殘渣1 g，加入體積分?jǐn)?shù)65%酸化乙醇20 mL，超聲5 min后4 000 r/min離心10 min，取上清液。按上述方法測定黑豆皮殘渣中的花色苷含量，以檢測是否提取完全。

1.3.3 中壓制備色譜分離黑豆皮花色苷

取5 g黑豆皮花色苷粗提物溶解到50 mL的體積分?jǐn)?shù)6%酸化甲醇(0.1%三氟乙酸酸化)中，制備花色苷濃縮液上樣。流速為50 mL/min，以體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸水溶液(A)和甲醇(B)作為流動相，檢測波長500 nm，收集波長519 nm，收集閾值為500 mAU。按表1所列條件洗脫。

表1 中壓色譜洗脫梯度Table 1 The elution gradient of medium-pressure liquid chromatography

1.3.4 黑豆皮中花色苷的鑒定

分別將中壓制備分離到的黑豆皮花色苷1峰、2峰、3峰用超純水稀釋過0.22 μm濾膜制樣，對樣品在m/z200～1 000內(nèi)進(jìn)行Q1掃描，選取各樣品中含量較高的分子離子峰，進(jìn)行二級質(zhì)譜產(chǎn)物離子掃描，優(yōu)化電壓以達(dá)到分離特征離子峰，對其進(jìn)行鑒定。

1.3.5 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷純度的鑒定

將2峰洗脫液進(jìn)行減壓濃縮并冷凍干燥，得固體樣品。用超純水溶解，過0.22 μm膜后進(jìn)行高效液相檢測，檢測波長280 nm，進(jìn)樣量10 μL，流速為1 mL/min，柱溫30 ℃。流動相A為體積分?jǐn)?shù)0.3%的甲酸，流動相B為甲醇，梯度洗脫條件如下：0～15 min，5%～30% B；15～25 min，30%～35% B；25～40 min，35%～100% B；40～50 min，100%～100% B；50～55 min 100%～5% B，55～65 min，5%～5% B。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗提物花色苷含量測定

2.1.1 黑豆皮花色苷最大吸收波長的確定

如圖1所示，將黑豆皮花色苷粗提品溶解后分別以pH=1和pH=4.5的緩沖液進(jìn)行稀釋，于400～800 nm波長內(nèi)進(jìn)行可見光掃描，可知黑豆皮花色苷的最大吸收波長為510 nm。

圖1 不同pH值下黑豆皮花色苷光譜掃描曲線Fig.1 The scanning curve of anthocyanins from black soybean peel with different pH value

2.1.2 平衡時間的確定

花色苷在水溶液中存在藍(lán)色的醌式堿、紅色的花烊正離子、無色的甲醇假堿和查爾酮4種結(jié)構(gòu)，其動態(tài)平衡隨pH值的改變而轉(zhuǎn)移，由于達(dá)到新的平衡需要一定的時間，所以在緩沖液稀釋后需靜置一段時間以達(dá)到再次平衡[21]。由表2可知，在pH值為1的緩沖液中，黑豆皮花色苷的吸光值隨著時間的增長而不斷增加，在60 min時基本達(dá)到穩(wěn)定；在pH值為4.5的緩沖液中，黑豆皮花色苷的吸光值隨時間的增長而不斷減小，在50 min時基本達(dá)到穩(wěn)定。因此，綜合考慮平衡時間選取為60 min。

表2 黑豆皮花色苷吸光值隨時間變化結(jié)果Table 2 The changes of absorption value with time

2.1.3 黑豆皮花色苷粗提品及殘渣中花色苷含量

由實驗結(jié)果計算得黑豆皮花色苷粗提品中總花色苷為(268.57±1.35) mg/g，黑豆皮殘渣中總花色苷含量為(0.31±0.31) mg/g，由此可見3次浸提可將黑豆皮中的花色苷基本浸提完全。本實驗采用1.5 kg黑豆皮，經(jīng)過醇提得到黑豆皮花色苷粗提品56.6 g，粗提品花色苷含量為(26.9±1.35)%，屬于正常范圍。由此結(jié)果可知，乙醇浸提法提取黑豆皮中的花色苷操作簡單，但提取物純度較低，還需進(jìn)一步分離純化。

2.2 中壓制備色譜分離黑豆皮花色苷粗提品

本實驗通過調(diào)整梯度洗脫程序、上樣量、流速等參數(shù)條件，優(yōu)化中壓制備色譜分離黑豆皮花色苷工藝，旨在分離得到較高純度的花色苷單體。經(jīng)過不斷調(diào)整，確定最大上樣量為5 g，當(dāng)上樣量大于5 g時，目標(biāo)化合物所在的2峰分離效果較差。矢車菊素3-O-葡萄糖苷在519 nm左右處存在特征吸收峰，故選取519 nm作為收集波長[22]。由圖2可知，經(jīng)過中壓制備色譜分離后，在519 nm波長下達(dá)到響應(yīng)值閾值500 mAU后自動收集對應(yīng)峰洗脫液，共收集到3個峰(收集時間分別為105～113，163～208，239～255 min)。其中，1峰、3峰成分較為復(fù)雜，可能有結(jié)構(gòu)相似的花色苷同時被洗脫下來，導(dǎo)致分離度不高。2峰分離效果較好，組分較為單一，含量也較高，但其成分和純度還需進(jìn)一步分析鑒定。

A-波長519 nm和500 nm色譜圖；B-波長280 nm和254 nm色譜圖圖2 中壓制備液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatography of medium-pressure liquid chromatography

2.3 黑豆皮花色苷的鑒定

分別取經(jīng)中壓制備色譜分離的黑豆皮花色苷1峰、2峰、3峰上質(zhì)譜進(jìn)行Q1掃描，并對其中豐度較高的離子進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描以鑒定其結(jié)構(gòu)。

2.3.1 黑豆皮1峰的鑒定

由圖3-A可知，黑豆皮1峰中成分較為復(fù)雜，存在大量非花色苷物質(zhì)，1峰中包含的主要花色苷分子質(zhì)荷比為579.10、737.15。對黑豆皮1峰中的m/z579.10進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描(碰撞電壓20 V)，由圖3-B可知，離子碎片m/z271為天竺葵素，為失去1個蕓香糖苷(579-271=308)中性碎片而形成，初步判斷為天竺葵素-3-O-蕓香糖苷[23]。對黑豆皮1峰中的m/z737.15進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描(碰撞電壓25 V)，結(jié)果見圖3-C，主要離子碎片有m/z287、329、423、575，其中特征離子碎片m/z287為矢車菊素，但具體結(jié)構(gòu)未知[24]。

A-黑豆皮1峰Q1掃描；B-黑豆皮1峰m/z 579.10產(chǎn)物離子掃描；C-黑豆皮1峰m/z 737.15產(chǎn)物離子掃描圖3 黑豆皮1峰質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrogram of peak 1 of anthocyanins from black soybean peel

2.3.2 黑豆皮2峰的鑒定

由圖4-A可知，黑豆皮2峰花色苷成分較為單一。對m/z449.15進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描(碰撞電壓15 V)，結(jié)果見圖4-B，離子碎片m/z287為矢車菊素，為失去1個葡萄糖苷(449-287=162)中性碎片而形成，初步判斷其為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷[25]。

A-黑豆皮2峰Q1掃描；B-黑豆皮2峰m/z 449.15產(chǎn)物離子掃描圖4 黑豆皮2峰質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrogram of peak 2 of anthocyanins from black soybean peel

2.3.3 黑豆皮3峰的鑒定

由圖5-A可知，與黑豆皮1峰類似，3峰中成分也較為復(fù)雜，包含的主要花色苷分子質(zhì)荷比為449.15、463.10、517.10、579.10。其中m/z449.15為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，其鑒定結(jié)果同2峰。m/z463.10鑒定為芍藥色素-3-O-葡萄糖苷[23](見圖5-B)，碎片離子m/z301為芍藥色素，為失去1個葡萄糖苷(463-301=162)中性碎片而形成。m/z517.10的特征離子碎片為m/z355和427，結(jié)合文獻(xiàn)鑒定為吡喃花色衍生物錦葵素-3-葡萄糖苷-4-乙醛(Vitisin B)[26-27](見圖5-C)。579.10m/z鑒定為天竺葵素-3-O-蕓香糖苷，結(jié)果同1峰對應(yīng)物質(zhì)。

A-黑豆皮3峰Q1掃描；B-黑豆皮3峰m/z 463.10產(chǎn)物離子掃描；C-黑豆皮3峰m/z 517.10產(chǎn)物離子掃描圖5 黑豆皮3峰質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectrogram of peak 3 of anthocyanins from black soybean peel

2.4 高效液相色譜鑒定花色苷成分

通過多次制備收樣，收集一定量的黑豆皮花色苷2峰洗脫液，減壓濃縮蒸去甲醇后冷凍干燥得固體粉末。根據(jù)質(zhì)譜分析結(jié)果，經(jīng)中壓制備色譜分離出的2峰較為單一，主要物質(zhì)為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，對其進(jìn)行高效液相色譜檢測，測定其純度，并與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對照，結(jié)果如圖6所示。圖6中樣品出峰時間22.4 min與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)品出峰時間相對應(yīng)，可判定為同一種物質(zhì)，采用峰面積積分計算其純度，結(jié)果顯示其純度為91.46%。可見，采用中壓制備色譜可有效將黑豆皮中含量較高的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷單體分離出來，采用這種方法對該單體進(jìn)行制備具有很好的可行性。

圖6 黑豆皮2峰高效液相色譜圖Fig.6 HPLC Chromatogram of peak 2

3 討論

本研究對黑豆皮的花色苷進(jìn)行浸提后采用大孔吸附樹脂吸附再酸洗，可去除黑豆皮浸提物中所含有的糖類、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)[28]。再采用pH示差法對粗分離得到的花色苷粗品和黑豆皮殘渣中的花色苷進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，采用體積分?jǐn)?shù)65%乙醇3次乙醇浸提可基本將黑豆皮中的花色苷提取完全。由于花色苷易遇熱見光分解[29]，所以整個提取粗分離過程，嚴(yán)格采用低溫避光，以保護(hù)花色苷的穩(wěn)定性。

采用中壓制備色譜對黑豆皮花色苷進(jìn)行分離純化，通過調(diào)整不同上樣量得到最大上樣量，可在5 h完成對5 g花色苷粗品的分離純化，并采用切割收集技術(shù)[30]對2峰進(jìn)行收集，冷凍干燥后可獲得2峰洗脫物固體粉末0.467 g，經(jīng)過質(zhì)譜技術(shù)和高效液相鑒定其主要物質(zhì)為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，純度為91.46%，達(dá)到了分離純化單體的目的。如要獲得更高純度的單體，可采用更集中的切割方法進(jìn)行收集。與其他制備技術(shù)相比較，半制備高效液相色譜相流動相需要色譜純級別，且上樣量只有毫克級別，而中壓制備色譜的流動相僅需分析純級別，且擁有更大的處理量，更適用于工業(yè)化生產(chǎn)。同時，中壓制備色譜柱可以自行裝填，本實驗根據(jù)所需分離物質(zhì)的極性選用C18反相填料純化，并設(shè)置保護(hù)柱以達(dá)到保護(hù)填料的目的。而相比較于近年來用于大量制備單體化合物的高效逆流色譜，優(yōu)勢則在于本實驗采用沸點較低的甲醇和甲酸作為流動相，容易去除以保證安全性；而逆流色譜一般采用高沸點、污染大的有機(jī)溶劑作為流動相，如正丁醇、正己烷等，容易造成花色苷中有機(jī)溶劑殘留。

此外，雖然本實驗針對黑豆皮中含量較高的花色苷矢車菊素-3-O-葡萄糖苷設(shè)計梯度洗脫曲線得到了較好的分離效果，但1峰和3峰分離效果不好，這與組分中花色苷的結(jié)構(gòu)及含量有關(guān)，可針對不同目標(biāo)物質(zhì)調(diào)整梯度洗脫曲線以達(dá)到更好的分離結(jié)果。同時，在前期大孔樹脂預(yù)分離過程中，也有大量目標(biāo)花色苷的損失，后期將會進(jìn)一步優(yōu)化工藝，以期獲得更多的目標(biāo)花色苷。

4 結(jié)論

本實驗以安徽亳州黑豆皮為原料，采用乙醇3次浸提提取黑豆皮花色苷，通過石油醚萃取和大孔樹脂吸附對花色苷進(jìn)行純化，并采用中壓制備色譜對其進(jìn)行分離，再采用質(zhì)譜技術(shù)和分析型高效液相對所分離得到的組分進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，采用乙醇3次浸提可將黑豆皮中的花色苷提取完全，采用中壓制備色譜可分離到純度91.46%的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷單體。其他黑豆皮中的主要花色苷鑒定為：天竺葵素-3-O-蕓香糖苷、芍藥色素-3-O-葡萄糖苷、錦葵素-3-葡萄糖苷-4-乙醛。本實驗采用的中壓制備色譜分離花色苷技術(shù)，最大上樣量可達(dá)到5 g，適用于花色苷單體的工業(yè)化生產(chǎn)，為黑豆皮的綜合利用及工業(yè)化生產(chǎn)花色苷提供了思路和依據(jù)。