李淑貞 楊艷梅 楊曉暉 崔茂香
(滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校,河北 滄州 061001)
最新數(shù)據(jù)〔1〕顯示,中國(guó)成年人糖尿病患病率高達(dá)11.6%,由此推測(cè)目前中國(guó)有1.139億糖尿病患者,其中2型糖尿病(T2DM)患者占糖尿病總數(shù)的90%~95%。糖尿病心肌病(DC)是糖尿病所致心血管系統(tǒng)損害的重要并發(fā)癥之一,可引起糖尿病患者心功能下降,最終導(dǎo)致充血性心力衰竭、心源性休克及猝死,與糖尿病患者心血管事件的高發(fā)生率和高死亡率密切相關(guān)〔2〕。研究證實(shí)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1是一種多功能生長(zhǎng)因子,在DC發(fā)病中具有重要作用。通絡(luò)玉液湯是在玉液湯、生脈散原方基礎(chǔ)上加減化裁而成,具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)之效。本實(shí)驗(yàn)通過心功能和TGF-β1等指標(biāo)的觀察,探討通絡(luò)玉液湯對(duì)DC大鼠的治療作用及其可能機(jī)制。
1.1一般資料 通絡(luò)玉液湯(生曬參、生黃芪、生山藥、麥冬、知母、花粉、葛根、五味子、雞內(nèi)金等)中藥飲片均購(gòu)自滄州同仁堂藥店。浸泡、煎煮、濃縮成2.5 g生藥/ml的液體;鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司。TRIZON 購(gòu)自新西蘭Invitrogen公司,RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自 TIANGEN生化科技(北京)有限公司,SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa大連寶生物工程有限公司。
1.2模型建立與藥物干預(yù) SPF級(jí)48只健康雄性SD大鼠 〔中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,合格證號(hào):SCXK-(軍)2009-003〕,體重 150~180 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后,參考董世芬等〔3〕方法,并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分為正常對(duì)照組(NC組) 和模型組。模型組先用高脂高糖飼料(20%蔗糖、10%豬油、2.5%膽固醇和67.5%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)4 w,然后一次性腹腔注射1% STZ 30 mg/kg,72 h后測(cè)大鼠空腹血糖(FBG),>11.1 mmol/L認(rèn)為是T2DM大鼠模型成功,持續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)6 w,即成DC模型。NC組一直采用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng),等量枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.4)代替STZ腹腔注射,不采血。選擇成模大鼠36只隨機(jī)分為3組:DC組,苯那普利陽(yáng)性藥物對(duì)照組(BP組),通絡(luò)玉液湯組(TYD組)。TYD組灌服通絡(luò)玉液湯煎劑25 g·kg-1·d-1;BP組灌服苯那普利 1 mg·kg-1·d-1;NC組和DC組每日灌服相應(yīng)劑量的生理鹽水,連續(xù)8 w。
1.3左心室功能檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束各組10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉,備皮仰臥位固定,進(jìn)行彩色多普勒超聲心動(dòng)圖檢查。二維超聲測(cè)量:左心室收縮末期內(nèi)徑(LVISD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVIDD)及射血分?jǐn)?shù)(EF),短軸縮短率(FS)。
1.4血糖及水平的測(cè)定 各組禁食不禁水12 h,由頸總動(dòng)脈取血檢測(cè)FBG。
1.5膠原容積分?jǐn)?shù)的測(cè)定 大鼠處死后取一部分左心室心肌組織以4%多聚甲醛固定,石蠟切片,常規(guī)Masson染色,光鏡下觀察心肌細(xì)胞呈紅色或黃色,膠原纖維呈藍(lán)綠色,拍片,掃描,采用圖像分析儀測(cè)量膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF,CVF=同一圖像中膠原面積/所測(cè)視野面積)。每個(gè)切片選取5個(gè)視野取其平均數(shù)。
1.6免疫組化測(cè)定心肌組織中TGF-β1蛋白表達(dá) 石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水,抗原修復(fù),血清封閉,滴加一抗,4℃冰箱過夜,滴加二抗,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn):以細(xì)胞質(zhì)被染成棕褐色為陽(yáng)性結(jié)果。每組標(biāo)本切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野,借助于HPIAS2000多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各組切片陽(yáng)性顆粒的平均灰度值反映TGF-β1的表達(dá)水平。
1.7實(shí)時(shí)定量RT-PCR測(cè)定心肌組織中TGF-β1 mRNA的表達(dá) ①RNA提取與cDNA的合成:取100 mg心肌組織,加入Trizol 1 ml,冰浴勻漿,提取總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度與濃度,電泳法檢測(cè)其完整性;取0.5 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA。②實(shí)時(shí)熒光定量PCR:按照 RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)。以β-actin為內(nèi)參,引物設(shè)計(jì)TGF-β1:正義5′-GCCTGAGTGGCTGTCTTTTGA-3′,反義5′-GGAAGGGTC-GGTTCATGTCAT-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為330 bp;β-actin的引物:正義5′-ATATCgCTgCgCTCgTCgT-3′,反義5′-TCTCTTGCTCTGGGCCTCGT-3′。PCR的反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 60 s;變性95℃ 10 s;58℃退火20 s;72℃延伸20 s,40個(gè)循環(huán)。引物均由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。以β-actin為內(nèi)參,采用ΔCt(ΔCt目的-ΔCt內(nèi)參)法進(jìn)行相對(duì)定量分析,以2-ΔCt作為目的 RNA 的相對(duì)表達(dá)量。
1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。
2.1TYD對(duì)DC大鼠血糖的影響 與NC組〔(5.82±1.12)mmol/L〕比較,DC組FBG〔(24.33±3.74)mmol/L〕明顯升高(P<0.01);經(jīng)用藥干預(yù)后,各治療組FBG明顯降低,與DC組比較,TYD組〔(10.42±2.52)mmol/L〕差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),BP組〔(23.98 ±4.09)mmol/L〕差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與BP組比較,TYD組FBG明顯降低(P<0.01)。
2.2TYD對(duì)DC大鼠左心室功能的影響 與NC組比較,DC組LVISD及 LVIDD明顯增大(P<0.01),EF和FS明顯下降(P<0.05);經(jīng)用藥干預(yù)后,各治療組LVISD及 LVIDD顯著降低,EF和FS顯著升高,與DC組比較LVISD、EF和FS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),但BP組和TYD組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1,圖1。
表1 各組心功能的比較
與NC組相比:1)P<0.01,2)P<0.05;與DC相比:3)P<0.01,4)P<0.05
圖1 各組心功能超聲心動(dòng)圖結(jié)果
2.3Masson染色觀察各組膠原表達(dá)情況 光鏡下:NC組心肌纖維完整,細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,膠原纖維主要分布在血管周圍,心肌細(xì)胞間有少量的膠原纖維,著色淡;DC組心肌纖維排列紊亂,心肌間隙增寬,有大量縱橫交錯(cuò)的膠原纖維,排列紊亂,分布不勻;BP組和TYD組心肌肌纖維排列基本規(guī)則,膠原纖維量要明顯少于DC組,尤以TYD組顯著。見圖2。與NC組(7.38±1.81)%比較,DC組CVF值(28.95±7.35)% 顯著升高(P<0.01);經(jīng)用藥干預(yù)后,各治療組CVF值降低,與DC組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05);TYD組CVF值(18.73±5.10)% 小于BP組(23.07±6.33)%,但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.4大鼠心肌組織TGF-β1基因、蛋白的表達(dá) 免疫組化結(jié)果:NC組心肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見少許黃色染色顆粒,TGF-β1無(wú)或微量表達(dá);DC組TGF-β1大量表達(dá),部分心肌細(xì)胞內(nèi)呈彌漫性強(qiáng)染色;BP組和TYD組心肌細(xì)胞內(nèi)免疫復(fù)合物染色范圍及強(qiáng)度均較輕,TGF-β1少量表達(dá),以TYD組最為明顯。定量分析:與NC組比較,DC組TGF-β1平均灰度值顯著降低(即TGF-β1蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng),P<0.01);經(jīng)用藥干預(yù)后,治療組TGF-β1平均灰度值明顯升高(即TGF-β1蛋白表達(dá)減弱),與DC組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與BP組比較,TYD組TGF-β1平均灰度值升高,但二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果:與NC組比較,DC組TGF-β1的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01);經(jīng)用藥干預(yù)后,各治療組TGF-β1的mRNA表達(dá)水平較DC組顯著下降(P<0.01)。與BP組比較,TYD組TGF-β1的mRNA表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。見表2。
圖2 各組心肌組織Masson染色(×400)
圖3 各組心肌組織TGF-β1免疫組化(×400)
組別TGF-β1蛋白TGF-β1 mRNANC120.59±10.020.016 89±0.004 0DC96.44±10.061) 0.165 31±0.057 51)BP105.66±6.783)0.106 00±0.026 72)TYD107.38±7.653) 0.062 67±0.021 72)4)
與NC組相比:1)P<0.01;與DC組相比:2)P<0.01,3)P<0.05;與BP組相比:4)P<0.05
DC作為一種特異的糖尿病心血管并發(fā)癥,是一種獨(dú)立于冠心病、高血壓、先心病和其他種類的心臟病之外的特異心臟病變,與糖尿病患者心力衰竭的高發(fā)生率和高死亡率密切相關(guān)〔4〕。DC的主要病理變化是心肌間質(zhì)纖維化,從而增加室壁的僵硬度,降低心室順應(yīng)性,導(dǎo)致心臟舒張與收縮功能障礙,最終引發(fā)心力衰竭。研究發(fā)現(xiàn)〔5~7〕,TGF-β1是一種多功能細(xì)胞因子,在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的形成中起重要作用,是體內(nèi)重要的促纖維化細(xì)胞因子,與糖尿病患者的心肌纖維化密切相關(guān):①持續(xù)高血糖可直接刺激TGF-β1表達(dá),引起心肌成纖維細(xì)胞分泌膠原,加速心肌纖維化;②高血糖引發(fā)的氧化應(yīng)激可通過增加核因子(NF)-κB進(jìn)入細(xì)胞核使得TGF-β1轉(zhuǎn)錄增多,從而刺激Ⅰ型和Ⅲ型膠原合成,引起心肌纖維化;③高糖狀態(tài)下,心肌經(jīng)過磷脂肌醇信號(hào)PKc途徑使腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)被激活,血管緊張素(Ang)Ⅱ表達(dá)增多,刺激心肌成纖維細(xì)胞中的TGF-β1分泌增多,促進(jìn)Ⅰ型、Ⅲ型膠原合成增加、分解減少,最終造成心肌肥厚及心肌纖維化。因此,抑制心肌組織中TGF-β1的高表達(dá)成為DC治療的靶標(biāo)。
本實(shí)驗(yàn)表明心臟收縮舒張及射血功能明顯降低;DC與高血糖狀態(tài)下的TGF-β1高表達(dá)有關(guān),與文獻(xiàn)報(bào)道相符〔8〕。本實(shí)驗(yàn)說明通絡(luò)玉液湯可有效降低血糖,并通過降低TGF-β1的表達(dá)來(lái)減輕DC心肌損傷,改善心功能,對(duì)DC大鼠心臟起明顯的保護(hù)作用。
1Xu Y,Wang L,He J,etal.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults〔J〕.JAMA,2013;310(9):948-59.
2黃婭茜,王 憲,孔 煒.糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展〔J〕.生理科學(xué)進(jìn)展,2010;41(1):31-6.
3董世芬,洪 纓,樊江波,等.實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病心肌病大鼠模型的建立與評(píng)價(jià)〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2009;17(4):245-51.
4Battiprolu PK,Lopez-Crisosto C,Wang ZV,etal.Diabetic cardiomyopathy and metabolic remodeling of the heart〔J〕.Life Sci,2013;92(11):609-15.
5陳銘林,吳 鏗.TGF-β1對(duì)糖尿病心肌病的影響〔J〕.臨床醫(yī)學(xué)工程,2014;21(2):261-4.
6Chen H,Yu B,Lu C,etal.The effect of intra-articular injection of different concentrations of ozone on the level of TNF-α,TNF-R1,and TNF-R2 in rats with rheumatoid arthritis〔J〕.Rheumatol Int,2013;33(5):1223-7.
7Malemud CJ.Anticytokine therapy for osteoarthritis:evidence to date〔J〕.Drugs Aging,2010;27(2):95-115.
8Ma YX,Li WH,Xie Q.Rosuvastatin inhibits TGF-beta1 expression and alleviates myocardial fibrosis in diabetic rats〔J〕.Die Pharmazie,2013;68(5):355-8.