通絡(luò)玉液湯對(duì)2型糖尿病心肌病大鼠心功能及心肌纖維化的影響

李淑貞 楊艷梅 楊曉暉 崔茂香

(滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校,河北 滄州 061001)

最新數(shù)據(jù)〔1〕顯示，中國(guó)成年人糖尿病患病率高達(dá)11.6%，由此推測(cè)目前中國(guó)有1.139億糖尿病患者，其中2型糖尿病(T2DM)患者占糖尿病總數(shù)的90%～95%。糖尿病心肌病(DC)是糖尿病所致心血管系統(tǒng)損害的重要并發(fā)癥之一，可引起糖尿病患者心功能下降，最終導(dǎo)致充血性心力衰竭、心源性休克及猝死，與糖尿病患者心血管事件的高發(fā)生率和高死亡率密切相關(guān)〔2〕。研究證實(shí)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1是一種多功能生長(zhǎng)因子，在DC發(fā)病中具有重要作用。通絡(luò)玉液湯是在玉液湯、生脈散原方基礎(chǔ)上加減化裁而成，具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)之效。本實(shí)驗(yàn)通過心功能和TGF-β1等指標(biāo)的觀察，探討通絡(luò)玉液湯對(duì)DC大鼠的治療作用及其可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 通絡(luò)玉液湯(生曬參、生黃芪、生山藥、麥冬、知母、花粉、葛根、五味子、雞內(nèi)金等)中藥飲片均購(gòu)自滄州同仁堂藥店。浸泡、煎煮、濃縮成2.5 g生藥/ml的液體；鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司。TRIZON 購(gòu)自新西蘭Invitrogen公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自 TIANGEN生化科技(北京)有限公司，SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa大連寶生物工程有限公司。

1.2模型建立與藥物干預(yù) SPF級(jí)48只健康雄性SD大鼠 〔中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：SCXK-(軍)2009-003〕，體重 150～180 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，參考董世芬等〔3〕方法，并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分為正常對(duì)照組(NC組) 和模型組。模型組先用高脂高糖飼料(20%蔗糖、10%豬油、2.5%膽固醇和67.5%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)4 w，然后一次性腹腔注射1% STZ 30 mg/kg，72 h后測(cè)大鼠空腹血糖(FBG)，>11.1 mmol/L認(rèn)為是T2DM大鼠模型成功，持續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)6 w，即成DC模型。NC組一直采用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，等量枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.4)代替STZ腹腔注射，不采血。選擇成模大鼠36只隨機(jī)分為3組：DC組，苯那普利陽(yáng)性藥物對(duì)照組(BP組)，通絡(luò)玉液湯組(TYD組)。TYD組灌服通絡(luò)玉液湯煎劑25 g·kg-1·d-1；BP組灌服苯那普利 1 mg·kg-1·d-1；NC組和DC組每日灌服相應(yīng)劑量的生理鹽水，連續(xù)8 w。

1.3左心室功能檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束各組10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉，備皮仰臥位固定，進(jìn)行彩色多普勒超聲心動(dòng)圖檢查。二維超聲測(cè)量：左心室收縮末期內(nèi)徑(LVISD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVIDD)及射血分?jǐn)?shù)(EF)，短軸縮短率(FS)。

1.4血糖及水平的測(cè)定 各組禁食不禁水12 h，由頸總動(dòng)脈取血檢測(cè)FBG。

1.5膠原容積分?jǐn)?shù)的測(cè)定 大鼠處死后取一部分左心室心肌組織以4%多聚甲醛固定，石蠟切片，常規(guī)Masson染色，光鏡下觀察心肌細(xì)胞呈紅色或黃色，膠原纖維呈藍(lán)綠色，拍片，掃描，采用圖像分析儀測(cè)量膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF，CVF=同一圖像中膠原面積/所測(cè)視野面積)。每個(gè)切片選取5個(gè)視野取其平均數(shù)。

1.6免疫組化測(cè)定心肌組織中TGF-β1蛋白表達(dá) 石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，血清封閉，滴加一抗，4℃冰箱過夜，滴加二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：以細(xì)胞質(zhì)被染成棕褐色為陽(yáng)性結(jié)果。每組標(biāo)本切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，借助于HPIAS2000多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各組切片陽(yáng)性顆粒的平均灰度值反映TGF-β1的表達(dá)水平。

1.7實(shí)時(shí)定量RT-PCR測(cè)定心肌組織中TGF-β1 mRNA的表達(dá) ①RNA提取與cDNA的合成：取100 mg心肌組織，加入Trizol 1 ml，冰浴勻漿，提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度與濃度，電泳法檢測(cè)其完整性；取0.5 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA。②實(shí)時(shí)熒光定量PCR：按照 RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)。以β-actin為內(nèi)參，引物設(shè)計(jì)TGF-β1：正義5′-GCCTGAGTGGCTGTCTTTTGA-3′，反義5′-GGAAGGGTC-GGTTCATGTCAT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為330 bp；β-actin的引物：正義5′-ATATCgCTgCgCTCgTCgT-3′，反義5′-TCTCTTGCTCTGGGCCTCGT-3′。PCR的反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 60 s；變性95℃ 10 s；58℃退火20 s；72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。引物均由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。以β-actin為內(nèi)參，采用ΔCt(ΔCt目的-ΔCt內(nèi)參)法進(jìn)行相對(duì)定量分析，以2-ΔCt作為目的 RNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1TYD對(duì)DC大鼠血糖的影響 與NC組〔(5.82±1.12)mmol/L〕比較，DC組FBG〔(24.33±3.74)mmol/L〕明顯升高(P<0.01)；經(jīng)用藥干預(yù)后，各治療組FBG明顯降低，與DC組比較，TYD組〔(10.42±2.52)mmol/L〕差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，BP組〔(23.98 ±4.09)mmol/L〕差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與BP組比較，TYD組FBG明顯降低(P<0.01)。

2.2TYD對(duì)DC大鼠左心室功能的影響 與NC組比較，DC組LVISD及 LVIDD明顯增大(P<0.01)，EF和FS明顯下降(P<0.05)；經(jīng)用藥干預(yù)后，各治療組LVISD及 LVIDD顯著降低，EF和FS顯著升高，與DC組比較LVISD、EF和FS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，但BP組和TYD組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1，圖1。

表1 各組心功能的比較

與NC組相比：1)P<0.01，2)P<0.05；與DC相比：3)P<0.01，4)P<0.05

圖1 各組心功能超聲心動(dòng)圖結(jié)果

2.3Masson染色觀察各組膠原表達(dá)情況 光鏡下：NC組心肌纖維完整，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，膠原纖維主要分布在血管周圍，心肌細(xì)胞間有少量的膠原纖維，著色淡；DC組心肌纖維排列紊亂，心肌間隙增寬，有大量縱橫交錯(cuò)的膠原纖維，排列紊亂，分布不勻；BP組和TYD組心肌肌纖維排列基本規(guī)則，膠原纖維量要明顯少于DC組，尤以TYD組顯著。見圖2。與NC組(7.38±1.81)%比較，DC組CVF值(28.95±7.35)% 顯著升高(P<0.01)；經(jīng)用藥干預(yù)后，各治療組CVF值降低，與DC組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)；TYD組CVF值(18.73±5.10)% 小于BP組(23.07±6.33)%，但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4大鼠心肌組織TGF-β1基因、蛋白的表達(dá) 免疫組化結(jié)果：NC組心肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見少許黃色染色顆粒，TGF-β1無(wú)或微量表達(dá)；DC組TGF-β1大量表達(dá)，部分心肌細(xì)胞內(nèi)呈彌漫性強(qiáng)染色；BP組和TYD組心肌細(xì)胞內(nèi)免疫復(fù)合物染色范圍及強(qiáng)度均較輕，TGF-β1少量表達(dá)，以TYD組最為明顯。定量分析：與NC組比較，DC組TGF-β1平均灰度值顯著降低(即TGF-β1蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，P<0.01)；經(jīng)用藥干預(yù)后，治療組TGF-β1平均灰度值明顯升高(即TGF-β1蛋白表達(dá)減弱)，與DC組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與BP組比較，TYD組TGF-β1平均灰度值升高，但二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果：與NC組比較，DC組TGF-β1的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；經(jīng)用藥干預(yù)后，各治療組TGF-β1的mRNA表達(dá)水平較DC組顯著下降(P<0.01)。與BP組比較，TYD組TGF-β1的mRNA表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。見表2。

圖2 各組心肌組織Masson染色(×400)

圖3 各組心肌組織TGF-β1免疫組化(×400)

組別TGF-β1蛋白TGF-β1 mRNANC120.59±10.020.016 89±0.004 0DC96.44±10.061) 0.165 31±0.057 51)BP105.66±6.783)0.106 00±0.026 72)TYD107.38±7.653) 0.062 67±0.021 72)4)

與NC組相比：1)P<0.01；與DC組相比：2)P<0.01，3)P<0.05；與BP組相比：4)P<0.05

3 討 論

DC作為一種特異的糖尿病心血管并發(fā)癥，是一種獨(dú)立于冠心病、高血壓、先心病和其他種類的心臟病之外的特異心臟病變，與糖尿病患者心力衰竭的高發(fā)生率和高死亡率密切相關(guān)〔4〕。DC的主要病理變化是心肌間質(zhì)纖維化，從而增加室壁的僵硬度，降低心室順應(yīng)性，導(dǎo)致心臟舒張與收縮功能障礙，最終引發(fā)心力衰竭。研究發(fā)現(xiàn)〔5～7〕，TGF-β1是一種多功能細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的形成中起重要作用，是體內(nèi)重要的促纖維化細(xì)胞因子，與糖尿病患者的心肌纖維化密切相關(guān)：①持續(xù)高血糖可直接刺激TGF-β1表達(dá)，引起心肌成纖維細(xì)胞分泌膠原，加速心肌纖維化；②高血糖引發(fā)的氧化應(yīng)激可通過增加核因子(NF)-κB進(jìn)入細(xì)胞核使得TGF-β1轉(zhuǎn)錄增多，從而刺激Ⅰ型和Ⅲ型膠原合成，引起心肌纖維化；③高糖狀態(tài)下，心肌經(jīng)過磷脂肌醇信號(hào)PKc途徑使腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)被激活，血管緊張素(Ang)Ⅱ表達(dá)增多，刺激心肌成纖維細(xì)胞中的TGF-β1分泌增多，促進(jìn)Ⅰ型、Ⅲ型膠原合成增加、分解減少，最終造成心肌肥厚及心肌纖維化。因此，抑制心肌組織中TGF-β1的高表達(dá)成為DC治療的靶標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)表明心臟收縮舒張及射血功能明顯降低；DC與高血糖狀態(tài)下的TGF-β1高表達(dá)有關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符〔8〕。本實(shí)驗(yàn)說明通絡(luò)玉液湯可有效降低血糖，并通過降低TGF-β1的表達(dá)來(lái)減輕DC心肌損傷，改善心功能，對(duì)DC大鼠心臟起明顯的保護(hù)作用。

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