石蠟切片中卵巢癌基因1第2外顯子PCR-SSCP檢測(cè)法建立

苗小艷 石 敏 李 巖 趙文嬌 孔繁斗 趙春艷

(大連醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116044)

卵巢癌基因(OVCA)1是與卵巢癌、乳腺癌等有關(guān)的腫瘤抑制基因〔1～5〕，定位于人染色體17p13.3〔1〕，該區(qū)域在卵巢癌中發(fā)生雜合性缺失(LOH)的頻率高達(dá)50%～86%〔2,6～9〕,研究顯示該基因缺失可能在卵巢癌早期階段即存在〔8〕。但關(guān)于OVCA1的生物學(xué)功能及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制目前尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌中OVCA1基因多個(gè)外顯子存在堿基突變〔3〕，本研究擬建立石蠟包埋切片標(biāo)本OVCA1第2外顯子的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1材料 石蠟包埋組織標(biāo)本來(lái)自大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2009年經(jīng)病理確診的卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌標(biāo)本3例、卵巢漿液性乳頭狀囊腺瘤4例和正常卵巢組織3例。石蠟包埋組織基因組DNA提取試劑盒(TaKaRa DEXPATTM)、DNA marker和PyrobestTMDNA聚合酶試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2基因組DNA的提取 按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作：將2枚10 μm石蠟包埋組織切片放入1.5 ml Ep管中，加入DEXPAT試劑0.5 ml。100 ℃加熱10 min，12 000 r/min 4 ℃離心10 min。將含有DNA水層移入另一新Ep管中作為PCR反應(yīng)模板。PCR擴(kuò)增 引物序列：上游5′-TTCCATCTCAATCTGGCTTC-3′，下游5′-CATCTGGGCCAGGCAAC-3′。擴(kuò)增條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min。3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段。

1.3SSCP檢測(cè) 5 μl DNA樣品加入等量SSCP上樣緩沖液〔10 ml上樣緩沖液中含有去離子甲酰胺9.4 ml，0.5 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)0.4 ml，5% 溴酚藍(lán)0.2 ml〕，混勻，98℃變性10 min，立即置于-20℃冰浴10 min。配制8%非變性聚丙烯酰胺凝膠，將上述樣品上樣、200 V、4℃電泳。電泳結(jié)束后，取出凝膠，置于固定液(含40%乙醇、10%醋酸)中固定30 min，去離子水漂洗5 min，重復(fù)3次。加入銀染溶液(0.012 mol/L硝酸銀)染色20 min，去離子水洗滌5 s，重復(fù)3次。加入顯色劑(1.5%NaOH、0.02%甲醛)輕輕晃動(dòng)，顯色30 s后，顯色液變黃或出現(xiàn)棕色顆粒。更換顯色液，輕輕搖動(dòng)，5 min后將凝膠移入終止液(10%醋酸)終止顯色反應(yīng)。取出凝膠，吸水紙吸干表面水分，拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1OVCA1基因第2外顯子的PCR擴(kuò)增結(jié)果 以提取自卵巢組織石蠟切片的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段(271 bp)，可見(jiàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物成單一條帶，條帶位置正確。見(jiàn)圖1。

2.2OVCA1第2外顯子的SSCP檢測(cè)結(jié)果 凝膠上可見(jiàn)3條清晰條帶。10例卵巢組織標(biāo)本中，DNA條帶數(shù)目及位置相同。見(jiàn)圖2。

1～3為卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌，4～7為卵巢漿液性乳頭狀囊腺瘤，8～10為正常卵巢組織，M為DL500 DNA marker；下圖同圖1 OVCA1第2號(hào)外顯子的PCR擴(kuò)增片段

圖2 OVCA1基因第2號(hào)外顯子的SSCP檢測(cè)

3 討 論

卵巢癌是婦科惡性腫瘤中死亡率最高的疾病，具有發(fā)病隱匿、早期診斷困難、預(yù)后差等臨床特點(diǎn)，絕大部分卵巢癌患者就診時(shí)已屬晚期，5年存活率僅為30%〔10〕，而早期卵巢癌的5年存活率可高達(dá)90%以上〔10,11〕。

抑癌基因缺失或突變導(dǎo)致功能喪失是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制。OVCA1是一個(gè)由12個(gè)外顯子組成、編碼443個(gè)氨基酸的抑癌基因〔2,6～9〕。有研究表明過(guò)表達(dá)OVCA1基因可抑制細(xì)胞增殖并阻滯于G1期〔3〕。敲除小鼠OVCA1基因后，腫瘤發(fā)生率明顯增加〔4〕。過(guò)表達(dá)OVCA1可通過(guò)p16途徑抑制卵巢癌細(xì)胞增殖〔12〕，并具有抑制卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用〔13〕。研究還發(fā)現(xiàn)在卵巢癌、乳腺癌等腫瘤中存在OVCA1基因多個(gè)外顯子突變〔3〕，但這種突變與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚不清楚。

PCR-SSOP技術(shù)為點(diǎn)突變的檢測(cè)手段〔14〕，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、無(wú)需特殊儀器設(shè)備、價(jià)格低廉、無(wú)需已知突變位點(diǎn)及序列等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于點(diǎn)突變的初步篩選〔14,15〕。本研究結(jié)果表明該P(yáng)CR擴(kuò)增條件適合OVCA1第2外顯子擴(kuò)增；本文所建立的SSCP電泳及染色條件適合用于OVCA1基因第2外顯子單鏈構(gòu)象的檢測(cè)。本研究顯示，所測(cè)3例卵巢癌和4例卵巢良性腫瘤中未檢出點(diǎn)突變。

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