結(jié)直腸息肉和結(jié)直腸癌中CD24和Lgr5的表達(dá)

薛偉彩 王建立 許建成 吳春曉 高記華

(河北省中醫(yī)院肛腸科，河北 石家莊 050011)

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一〔1〕,結(jié)直腸瘤性息肉是直腸癌的重要癌前病變，認(rèn)為93%的結(jié)直腸腺癌由腺瘤惡變而來〔2〕。腺瘤性息肉的大小、形態(tài)、數(shù)量及病理類型是其癌變的重要因素〔3,4〕。息肉越大，癌變率越高，特別是>2 cm的腺瘤性息肉的惡變率高達(dá)50%。腺瘤的數(shù)目增多，其癌變率相應(yīng)增加，廣基息肉更易癌變，而息肉的病理類型也是其重要的癌變因素，絨毛狀腺瘤的癌變率可高達(dá)30%以上。腺瘤切除后結(jié)直腸癌的發(fā)生率明顯降低。一般情況下，良性腺瘤向癌發(fā)展的過程是一個(gè)長(zhǎng)期的過程，歷時(shí)5～10年〔5〕，這就為臨床預(yù)防、早期診斷和早期治療結(jié)直腸癌提供了機(jī)會(huì)和可能。目前關(guān)于結(jié)直腸息肉發(fā)生癌變的具體機(jī)制尚不清楚。為何臨床上發(fā)現(xiàn)絨毛狀腺瘤較管狀腺瘤性息肉癌變概率高，而炎性及增生性息肉基本不癌變也沒有明確的原因。近年研究證實(shí)，腸道中正常存在的干細(xì)胞的功能紊亂，如自我更新、克隆增殖、分化和凋亡失去平衡，不但與腸息肉和直腸結(jié)腸癌的發(fā)生有直接或者間接的關(guān)系，而且很有可能是腫瘤細(xì)胞的最早起源〔6〕。因此，從細(xì)胞和分子生物學(xué)水平上研究腸息肉發(fā)生規(guī)律及原因，對(duì)于腸息肉相關(guān)腫瘤的早期診斷、結(jié)直腸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)及尋找新的治療方法和新的靶點(diǎn)具有非常重要的意義。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量與腫瘤干細(xì)胞相關(guān)的表面標(biāo)志物，在這些標(biāo)志物中與大腸癌相關(guān)的較為引人注意的包括CD24和富含亮氨酸重復(fù)系列G蛋白耦聯(lián)受體(Lgr)5。本研究探討結(jié)直腸癌、結(jié)直腸息肉中CD24、Lgr5的表達(dá)。

1 材料和方法

1.1材料 本研究100例結(jié)直腸息肉和結(jié)直腸腺癌標(biāo)本均來自河北省中醫(yī)院內(nèi)鏡室2012年1月至2013年12月行結(jié)腸鏡檢查或治療的病例。其中，炎性增生性息肉、管狀腺瘤性息肉、絨毛狀腺瘤性息肉各20例和腺癌40例，其異型增生程度分別為無異型增生22例、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變28例、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變10例。直徑<1.0 cm息肉27例，直徑1.0～2.0 cm息肉25例，直徑>2.0 cm息肉8例。全部100例患者男66例，女34例，年齡26～79歲，<40歲26例，≥40歲74例。選擇同期腸鏡下活檢，病理證實(shí)正常的結(jié)直腸黏膜20例為對(duì)照組。通過免疫組化染色，觀察患者CD24和Lgr5的表達(dá)情況，所有病理切片由兩名副主任病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片后統(tǒng)計(jì)分析。

1.2方法 所有標(biāo)本在10%中性甲醛溶液中固定，普通石蠟包埋。HE染色：首先將各種類型組織連續(xù)切片，厚度4 μm，將4 μm石蠟切片進(jìn)行二甲苯脫蠟、酒精水合，用蘇木素染核5 min，自來水沖洗，氨水反藍(lán)1 min，自來水沖洗，用伊紅染胞質(zhì)3 min，自來水沖洗，95%酒精分化30 s，最后用二甲苯透明15～20 min后封片，在顯微鏡下觀察攝片。免疫組化染色，先做預(yù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)染色效果確定CD24第一抗體最佳濃度為1∶200;Lgr5第一抗體最佳濃度為1∶100，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作空白對(duì)照，已知陽性片作陽性對(duì)照。具體步驟：①脫蠟脫水處理:石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各10 min,而后放入無水乙醇、95%乙醇、75%乙醇各5 min,PBS浸泡10 min;②去除內(nèi)源性過氧化物酶活性:將玻片放入3%H2O2:溶液10 min,PBS沖洗3次，每次5 min;③抗原修復(fù):將切片置入pH6.0的SSC緩沖液容器中，700 W微波加熱10 min，修復(fù)抗原。冷卻至室溫后用PBS沖洗3次，每次3 min；④加一抗:分別滴加CD24,Lgr5抗體，然后置于4℃冰箱孵育24 h,37℃溫箱復(fù)溫15 min后，用PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min;⑤加二抗:方法同前；⑥二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色:采用1∶50顯色，于鏡下觀察染色程度。染色滿意后封片；⑦蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，逆梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果并攝片。

1.3免疫組化染色結(jié)果判斷 光鏡下觀察組織切片的顯色反應(yīng)，CD24的陽性表達(dá)以腺體細(xì)胞膜染色為主，胞質(zhì)可有少量染色，呈黃色或棕黃色顆粒狀為陽性染色;Lgr5的表達(dá)以胞質(zhì)呈紅色或紫色為陽性染色。高倍鏡下(×400)每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，進(jìn)行視野內(nèi)腺體細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算陽性細(xì)胞所占比例。腺體細(xì)胞無著色為(-);<25%的細(xì)胞著色(+);25%～50%的細(xì)胞著色為();>50%的細(xì)胞著色為()。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，兩變量之間的關(guān)系采用相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1CD24和Lgr5的表達(dá)結(jié)果 CD24陽性的表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜，陽性反應(yīng)為細(xì)胞膜呈黃色或棕黃色。在正常腸黏膜、炎性息肉未見CD24陽性表達(dá)，但在腺瘤組和腺癌組中有不同程度表達(dá)，且多為強(qiáng)陽性。CD24陽性表達(dá)與組織類型的關(guān)系:在非腺瘤、管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、腺癌序列中，CD24陽性率逐漸增高，兩變量相關(guān)分析顯示CD24陽性率與息肉病理類型有相關(guān)性(r=0.627,P<0.01)。正常結(jié)直腸黏膜與炎性息肉之間，管狀腺瘤與絨毛狀腺瘤之間CD24陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但正常結(jié)直腸黏膜、炎性息肉與腺瘤組(包括管狀腺瘤和絨毛狀腺瘤);腺瘤組與腺癌組之間比較CD24表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Lgr5陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，以胞質(zhì)呈紅色或紫色為陽性染色。正常黏膜細(xì)胞核和細(xì)胞膜幾乎不著色，但在腺瘤和腺癌中，腺體細(xì)胞膜也有一定的表達(dá)。在正常腸黏膜未見Lgr5表達(dá)，但在炎性息肉、腺瘤組和腺癌組有不同程度表達(dá)，而在腺瘤組和腺癌組多為強(qiáng)陽性(～)。在正常結(jié)直腸黏膜、炎性息肉、管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、腺癌序列中，Lgr5表達(dá)呈逐漸增高趨勢(shì)，兩變量相關(guān)分析顯示Lgr5陽性率與息肉病理類型有相關(guān)性(r=0.563,P<0.05)。正常結(jié)直腸黏膜與炎性息肉之間、管狀腺瘤與絨毛狀腺瘤之間及腺瘤組(包括管狀腺瘤和絨毛狀腺瘤)與腺癌組比較，Lgr5陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但正常結(jié)直腸黏膜與腺瘤組之間、炎性息肉組與腺瘤組以及正常結(jié)直腸黏膜和炎性息肉與腺癌組之間比較Lgr5陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 CD24和Lgr5在結(jié)直腸各種組織中的表達(dá)〔n(%)〕

與腺癌組比較：1)P<0.05；與管狀腺瘤組及絨毛狀腺瘤組比較：2)P<0.05

2.2CD24和Lgr5表達(dá)與息肉大小的關(guān)系 CD24陽性率隨著息肉直徑的逐漸增加而遞增，兩變量相關(guān)分析顯示CD24陽性率與息肉大小有相關(guān)性(r=0.345,P<0.05)。直徑<1.0 cm與直徑>2.0 cm息肉中CD24陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.366,P<0.05);直徑<1.0 cm與直徑1.0～2.0 cm息肉中CD24陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.876,P<0.05);而直徑1.0～2.0 cm與直徑>2.0 cm息肉中，CD24陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.916，P>0.05)。Lgr5陽性率隨著息肉直徑的逐漸增加而遞增，但兩變量相關(guān)分析顯示Lgr5陽性率與息肉大小有相關(guān)性(r=0.419,P<0.01)。直徑<1.0 cm與直徑1.0～2.0 cm息肉比較Lgr5陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.816,P<0.01);直徑<1.0 cm與直徑>2.0 cm的息肉比較Lgr5陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.291,P<0.05);而直徑1.0～2.0 cm與直徑>2.0 cm息肉比較，Lgr5陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 CD24和Lgr5在結(jié)直腸息肉中的表達(dá)〔n(%)〕

與<1.0 cm組比較：1)P<0.05

2.3CD24和Lgr5表達(dá)與結(jié)直腸息肉異型增生的關(guān)系 CD24陽性率隨著無異型增生、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及腺癌組逐漸遞增，兩變量相關(guān)分析顯示CD24陽性率與異型增生程度有相關(guān)性(r=0.579,P<0.05)。無異型增生與低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變之間CD24陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.608,P<0.01)，低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組CD24陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變與腺癌組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.692,P<0.01)。高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變與腺癌組之間CD24陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Lgr5陽性率隨著無異型增生、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及腺癌組逐漸增加，但兩變量相關(guān)分析顯示Lgr5陽性率與異型增生程度呈相關(guān)性(r=0.524，P<0.01)。但無異型增生組與低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組和腺癌組之間兩兩比較，Lgr5陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組和腺癌組之間兩兩比較Lgr5陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 CD24和Lgr5表達(dá)與結(jié)直腸息肉異型增生的關(guān)系〔n(%)〕

與低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組比較：1)P<0.05；與無異型增生組比較：2)P<0.05

2.4CD24和Lgr5表達(dá)與年齡、性別的關(guān)系 CD24陽性率在<40歲和≥40歲之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.899,P<0.05),在男性和女性兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.304，P>0.05)。Lgr5陽性率在<40歲和≥40歲之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.273，P>0.05)，在男性和女性兩組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.027,P>0.05)，見表4。

表4 CD24和Lgr5表達(dá)與年齡、性別的關(guān)系〔n(%)〕

與<40歲組比較：1)P<0.05

3 討 論

研究證明結(jié)直腸息肉被切除后結(jié)直腸癌的發(fā)病率降低了76%～90%〔7〕。隨著對(duì)腫瘤細(xì)胞研究的不斷深入，越來越多的研究者提出腫瘤形成的干細(xì)胞起源學(xué)說。在惡性腫瘤組織中并非所有腫瘤細(xì)胞都具有惡性特征，僅少量腫瘤細(xì)胞具有無限增殖、自我更新和多向分化潛能，在惡性腫瘤的發(fā)展過程中起著干細(xì)胞的作用，可以形成各種分化程度的腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞，是維持惡性腫瘤組織形成、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)及腫瘤耐藥的根源，它們?cè)趷盒阅[瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中起著決定性的作用，這類細(xì)胞被稱之為腫瘤干細(xì)胞。通過特異性表面標(biāo)志，可以對(duì)腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行分離純化，這些腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物有CD44、CD24、 CD133、 CD166、 EpCAM和Lgr5等〔8，9〕。因此通過檢測(cè)某些有價(jià)值的腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物，對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行早期預(yù)測(cè)、診斷和早期治療。

CD24是一種低分子量高度糖基化的黏蛋白樣的黏附分子，它通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)而錨定于細(xì)胞膜糖脂富集區(qū)域上〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)，在人類許多惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌和胰腺癌及子宮惡性腫瘤等組織中均有高表達(dá)〔11，12〕。最近發(fā)現(xiàn)CD24在結(jié)直腸癌中有表達(dá)，并認(rèn)為是在結(jié)直腸癌多級(jí)演進(jìn)過程中的早期階段，它對(duì)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲及淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等具有重要作用，而且CD24的高表達(dá)與腫瘤的惡性傾向密切相關(guān)，可能對(duì)患者的臨床預(yù)后有一定的影響〔13，14〕。本研究中CD24表達(dá)增強(qiáng)發(fā)生在結(jié)直腸癌腫瘤形成的早期階段，可能參與結(jié)直腸癌的腫瘤形成過程。

Lgr5為跨膜糖蛋白，屬于糖蛋白激素類受體，最初發(fā)現(xiàn)其在胎盤、骨骼肌、腦組織和脊髓中有表達(dá)，控制著胎盤組織的分化和生長(zhǎng)〔15〕。后來發(fā)現(xiàn)其在卵巢癌、肝癌、基底細(xì)胞癌和結(jié)直腸癌中高表達(dá)〔16，17〕。Barker等〔8〕發(fā)現(xiàn)Lgr5表達(dá)在腸道隱窩基底部，并提出了其作為腸道腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的理論。近年研究表明，Lgr5可能參與了結(jié)直腸癌等腫瘤發(fā)生、發(fā)展，其表達(dá)可能是結(jié)直腸癌等腫瘤發(fā)生的重要早期指標(biāo)〔18,19〕。本研究進(jìn)一步證實(shí)Lgr5的陽性表達(dá)增強(qiáng)可能是結(jié)直腸癌的早期事件。

2006年美國(guó)胃腸內(nèi)鏡學(xué)會(huì)提出的最新指南將大腸癌篩查的年齡定為50歲，而國(guó)內(nèi)有學(xué)者將大腸癌篩查的年齡定為40歲，認(rèn)為>40歲是息肉癌變的一個(gè)危險(xiǎn)因素〔20〕。孫艷等〔21〕研究提示結(jié)直腸癌組織Lgr5 mRNA在不同性別和年齡間的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與之相符，由此可提示雖然CD24和Lgr5的表達(dá)都可能參與結(jié)直腸癌的形成過程，都是結(jié)直腸息肉癌變的有價(jià)值指標(biāo)和結(jié)直腸癌的重要的早期指標(biāo)，但CD24表達(dá)與年齡因素有關(guān)，而Lgr5表達(dá)與年齡因素?zé)o關(guān)。

總之，在非腺瘤、管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、腺癌序列中，CD24和Lgr5的表達(dá)逐漸增加。隨著結(jié)直腸息肉大小的增加，CD24和Lgr5的表達(dá)逐漸遞增。CD24表達(dá)受年齡的影響，而Lgr5的表達(dá)則與年齡無關(guān)，所以推測(cè)Lgr5表達(dá)的檢測(cè)較CD24可能是更好的早期指標(biāo)。CD24和Lgr5的表達(dá)與性別無關(guān)。CD24和Lgr5都是結(jié)直腸息肉惡變的重要參考指標(biāo)，對(duì)它們的檢測(cè)可以為結(jié)直腸癌的早期診斷提供一定的幫助。

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