ON123300對ER陽性人乳腺癌MCF-7細胞的影響及機制研究

林榮杰 尹 航 周云峰

乳腺癌的發(fā)病率已經(jīng)位居我國城鄉(xiāng)女性惡性腫瘤的首位，是危及女性生命健康最主要的惡性腫瘤之一，并呈現(xiàn)明顯的上升趨勢[1]。約75%的乳腺癌患者為激素受體陽性(HR+)的乳腺癌，內(nèi)分泌治療為此類患者提供了重要幫助，然而內(nèi)分泌藥物耐藥是HR+乳腺癌治療面臨的最大挑戰(zhàn)[2-3]。雖然CDK4/6抑制劑Palbociclib能夠有效克服內(nèi)分泌耐藥，但仍然存在原發(fā)耐藥和繼發(fā)耐藥問題(耐藥率分別約16%和約50%)[4]。其機制可能與其脫靶有關(guān)，脫靶問題也成為目前制約激酶抑制劑應用的最主要原因之一[5]。因此，設(shè)計更高效的針對CDK4的抑制劑從而避免其脫靶現(xiàn)象是亟待解決的問題。

ON123300是一種新型的以CDK4/6為主要靶點的多靶點激酶抑制劑，有研究報道其在多發(fā)性骨髓瘤、套細胞淋巴瘤及腦部腫瘤都呈現(xiàn)很好的療效，相比于一代Palbocilib效果優(yōu)勢明顯[6-8]。但ON123300在乳腺癌中的作用效果尚無報道。本研究旨在探討其對ER+，HER2-的乳腺癌細胞MCF-7增殖、周期、凋亡等影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物與試劑

MCF-7細胞購于中科院上海生物細胞所；ON123300(S8161)購于上海藍木化工有限公司；Palbocilib(PD0332991)購于Med Chem Express(MCE)公司；CCK-8試劑盒(c 6005)購于蘇州宇恒生物科技有限公司；Propidium iodide(PI)(P4170)購于Sigma公司；核糖核酸酶A(RNase A)(R4875)購于Sigma公司；細胞凋亡試劑盒(F6012)購于蘇州宇恒生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) MCF-7細胞培養(yǎng)于含10%的小牛血清及100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8檢測細胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔約5×103個細胞于100 μL培養(yǎng)基中孵育過夜后加藥，DMSO對照組分別給予0 μM、2 μM、4 μM、6 μM、8 μM、10 μM的ON123300或Palbocilib處理，每個濃度設(shè)置6個復孔；于培養(yǎng)箱中孵育48 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm波長測量各孔吸光度(OD)值并計算不同濃度藥物對細胞的抑制率。計算公式：細胞增殖抑制率(%)=[1-(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞周期和細胞凋亡 收集加藥后培養(yǎng)48 h的細胞，用不含EDTA的0.25%胰酶消化細胞，終止消化后收集細胞，PBS重懸潤洗2次；離心去上清，100 μL PBS重懸細胞，緩慢加入700 μL預冷的80%乙醇，使乙醇終濃度為70%；4℃固定4 h以上；1 000 rpm，5 min，預冷PBS潤洗2次；加入100 μL RNase A(50 μg/mL)，37℃孵育30 min；加400 μL PI(50 μg/mL)，4℃避光染色30 min；流式細胞儀檢測細胞周期。按細胞凋亡試劑盒實驗步驟操作后于FCM檢測細胞凋亡。CytExpert軟件分析細胞周期及凋亡情況。

1.2.4 Western blot 收集DMSO對照組、ON123300低濃度處理組(0.5 μM)和ON123300高濃度處理組(5.0 μM)細胞，提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加熱變性后上樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，4℃一抗孵育過夜，二抗室溫孵育一小時后ECL顯影。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，計數(shù)資料使用卡方檢驗，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ON123300及Palbocilib對MCF-7細胞生長狀態(tài)的影響

光學顯微鏡下可見，DMSO對照組細胞貼壁生長、增殖迅速，細胞生長狀態(tài)良好；ON123300加藥組較對照組及同濃度Palbocilib加藥組出現(xiàn)明顯的細胞增殖抑制，細胞明顯回縮脫落，細胞生長狀態(tài)差，并且呈現(xiàn)劑量依賴現(xiàn)象，ON123300劑量越高，MCF-7細胞生長狀態(tài)越差(圖1)。

2.2 ON123300及Palbocilib對MCF-7細胞增殖抑制的影響

與DMSO對照組相比，ON123300及Palbocilib對MCF-7的增殖抑制率隨濃度增高而增大(P<0.05)，同濃度的ON123300較Palbocilib對MCF-7的增殖抑制作用更強(P<0.05)。ON123300作用于MCF-7細胞的IC50為3.51 μM，而Palbocilib作用于MCF-7細胞的IC50為7.96 μM(圖2)。

ON123300會引起MCF-7細胞周期阻滯，與DMSO對照組相比，ON1233300處理組的MCF-7細胞出現(xiàn)明顯的G1/S期阻滯，G1期明顯延長，S期明顯縮短，對比組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3)。

圖1 各組MCF-7細胞形態(tài)學改變情況Figure 1 The morphological changes of MCF-7 cells in each groupNote：A.The cells in the control group；B.The cells were treated with 0.5 μM Palbocilib for 48 h；C.The cells were treated with 5.0 μM Palbocilib for 48 h；D.The cells were treated with 0.5 μM ON123300 for 48 h；and E.The cells were treated with 5.0 μM ON123300 for 48 h.

圖2 Palbocilib和ON123300對細胞增殖率的影響Figure 2 The proliferating rates of MCF-7 cells treated with palbocilib or ON123300

圖5 ON123300對survivin/cyclinD1/CDK4/Rb和PI3K的蛋白表達的影響Figure 5 The expression of survivin/cyclinD1/CDK4/Rb and PI3K protein in MCF-7 cells treated with different concentrations of ON123300

圖3 ON123300對MCF-7細胞周期的影響Figure 3 The distribution of cell cycle in MCF-7 cells treated with ON123300Note：A.The cells in the control group；B.The cells were treated with 0.5 μM of ON123300 for 48 h；and C.The cells were treated with 5.0 μM of ON123300 for 48 h.

2.3 ON123300促進MCF-7細胞凋亡

與DMSO對照組相比，ON123300低濃度組(0.5 μM)和高濃度組(5.0 μM)均出現(xiàn)明顯凋亡，且以高劑量組更顯著，對比組之間差異具有統(tǒng)計學意義，(P<0.05)(圖4)。

2.4 ON123300對MCF-7細胞的影響機制

與DMSO對照組相比，ON123300處理組的survivin、cyclinD1、CDK4、pRbs807/811及PI3K的蛋白表達量均明顯降低，對比組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖5)。

圖4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況Figure 4 The apoptosis of MCF-7 cells treated with ON123300 by flow cytometryNote：A.The cells in the control group；B.The cells were treated with 0.5 μM of ON123300 for 48 h；C.The cells were treated with 5.0 μM of ON123300 for 48 h；and D.The apoptosis of MCF-7 cells treated with ON123300.

3 討論

乳腺癌已成為我國女性第一大高發(fā)惡性腫瘤，嚴重危害女性的生命健康[9-10]。其中ER+、HER2-的乳腺癌患者約占3/4，內(nèi)分泌治療耐藥成為影響此類患者生存獲益的主要瓶頸之一。目前，以Palbocilib為代表的細胞周期依賴性激酶CDK4/6抑制劑已被FDA批準聯(lián)合內(nèi)分泌治療用于ER+、HER2-的乳腺癌患者治療[11]，但是CDK4/6抑制劑在臨床應用中存在脫靶及耐藥問題限制其應用[4]。分析主要原因可能為目前使用的CDK4/6抑制劑的效價并不高，另外在乳腺癌中存在其他參與細胞周期信號通路的持續(xù)激活如PI3K信號通路，細胞周期抑制劑P21和P27同時受其調(diào)控，從而參與調(diào)控細胞周期[4]。因此，與CDK4/6單靶點抑制劑相比，高效抑制CDK4/6且同時抑制PI3K激酶的藥物可能具有較好的療效。

ON123300是一種高效的基于CDK4/6的多靶點激酶抑制劑，體外Kinase assay實驗顯示其抑制CDK4/cyclinD1的IC50為3.87 nM[12]。在套細胞淋巴瘤中，ON123300通過雙重抑制CDK4/Rb和PI3K/Akt/mTOR信號通路不僅引起細胞周期阻滯，高濃度明顯促進細胞凋亡，而一代的CDK4/6抑制劑Palbocilib并不能促進細胞凋亡[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與Palbocilib相比，ON123300對乳腺癌細胞MCF-7具有更強的增殖抑制作用，細胞出現(xiàn)明顯的脫落。ON123300引起MCF-7細胞明顯的G1/S期阻滯，并伴有嚴重凋亡。有研究表明，survivin與CDK4結(jié)合形成survivin/CDK4復合物，競爭性地使P16與CDK4分離，將CDK4運送至細胞核后被cyclinD1/CDK4復合物取代，引起Rb磷酸化進而使細胞從G1期進入S期[13-15]。本研究Western blot結(jié)果顯示ON123300不僅明顯抑制MCF-7細胞中對細胞周期起重要調(diào)控作用的survivin/cyclinD1/CDK4/Rb信號通路，同時抑制了乳腺癌中調(diào)控細胞周期的PI3K信號通路，因此較Palbocilib這類特異性的CDK4/6抑制劑，ON123300不僅對CDK4/cyclinD1靶點有更強的抑制作用，而且可以有效抑制PI3K激酶，從而阻滯雙重周期相關(guān)通路。因此ON123300既避免了Palbocilib等一代CDK4/6抑制劑因效價不高而出現(xiàn)的脫靶現(xiàn)象，又避免了單靶點抑制劑對細胞周期通路抑制的不充分性。

綜上所述，ON123300通過雙重高效抑制CDK4和PI3K激酶靶點，繼而抑制survivin/cyclinD1/CDK4/Rb和PI3K信號通路，對ER+、HER2-的乳腺癌細胞具有明顯增殖抑制，促進G1/S期細胞阻滯和細胞凋亡的作用。與一代Palbocilib相比，具有明顯的殺傷優(yōu)勢。ON123300有望成為治療ER+、HER2-乳腺癌患者的有效藥物，其臨床應用效果和價值需要進一步研究驗證。