肌肉衰減綜合征小鼠腓腸肌Sirt1和mTOR活性的變化

荊小馬，王全全，郝延磊

(1.山東大學(xué) 齊魯醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，山東 濟(jì)寧 272000)

肌肉衰減綜合征(sarcopenia)被定義為增齡相關(guān)的進(jìn)行性全身肌量減少和/或肌強(qiáng)度下降或肌肉生理功能減退[1]。氧化應(yīng)激增加是肌肉衰減綜合征的重要發(fā)病機(jī)制之一，增齡和(或)廢用〔如后肢懸提(hindlimb suspension, HLS)〕可增加嚙齒類動(dòng)物肌肉組織中的氧化應(yīng)激反應(yīng)[2]。作為新發(fā)現(xiàn)的壽命和衰老調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，沉默接合型信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1，Sirt1)和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中對(duì)氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用。Sirt1不僅去乙?；M蛋白，而且去乙?；墙M蛋白(主要包括轉(zhuǎn)錄因子或輔助因子等)，如過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator- 1，PGC- 1α)、 P53 和叉狀頭螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead helix transcription factors, FOXO)1等，從而通過激活或抑制這些靶蛋白而發(fā)揮作用。Sirt1和mTOR是否參與了肌肉衰減綜合征的發(fā)病，目前研究較少。本研究觀察老年小鼠HLS對(duì)腓腸肌Sirt1和mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響，為肌肉衰減綜合征發(fā)病機(jī)制及防治提供參考。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)老年(26月齡)和中年(6月齡)C57BL/6J雄性小鼠各16只[山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(魯)20140007]。

1.1.2主要試劑：抗鼠Sirt1、 PGC- 1α、FOXO1、P53和煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase, NAMPT)多克隆抗體(Abcam公司)；抗鼠p-mTOR(Ser2448)、mTOR、p-4E-BP1(Thr37/46)、4E-BP1、p-p70S6K(Thr389)、 p70S6K及GAPDH抗體(Cell Signaling公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(Sigma-Aldrich公司)；NAD+/NADH定量試劑盒(NAD+/NADH quantification kit)(BioVision 公司)；Sirt1脫乙?；笩晒庠噭┖?Cyclex SIRT1/Sir2 deacetylsase fluorometric assay kit)(MBL國(guó)際公司)。

1.2　方法

1.2.1動(dòng)物模型的制備及分組：8只老年(26月齡)小鼠HLS 2周以建立肌肉衰減綜合征小鼠模型[3]。老年鼠HLS是常用的肌肉衰減綜合征造模方法[4]，該模型能夠模擬臨床肌肉衰減綜合征。老年和中年C57BL/6J雄性小鼠各16，只隨機(jī)分為對(duì)照組和HLS組(每組8只)，即中年對(duì)照(middle-aged control，MC)組、中年后肢懸提(middle-aged suspension，MS)組、老年對(duì)照 (aged control，AC)組及老年后肢懸提(aged suspension，AS)組。

1.2.2樣本采集：在HLS 2周后腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛麻醉，快速分離雙側(cè)后肢的腓腸肌并稱重。

1.2.3肌肉組織細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核的分離和相關(guān)測(cè)量：肌肉組織放入含0.5 mol/L二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)、蛋白酶抑制劑和磷脂酶抑制劑的勻漿液(250 mmol/L sucrose, 20 mmol/L HEPES, 10 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L EGTA, 0.1 mmol/L PMSF)進(jìn)行勻漿。40 ℃ 800×g離心10 min后收集上清液和沉淀物。沉淀物懸浮于冰冷的含0.5 mol/L NaCl和蛋白酶抑制劑的細(xì)胞核裂解液(10 mmol/L NaCl, 1.5 mmol/L MgCl2, 20 mmol/L HEPES, 20% Glycerol, 0.1% Triton X- 100, 1 mmol/L DTT)中，然后在40 ℃裂解2 h。40 ℃,15 000 r/min離心15 min后收集上清液，獲得不含細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞核蛋白。最后利用抗組蛋白H2B(histone-H2B)抗體和抗銅鋅過氧化物歧化酶(CuZn superoxide dismutase, CuZnSOD)和抗錳過氧化物歧化酶(Mn superoxide dismutase, MnSOD) 抗體對(duì)分離的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白的純度進(jìn)行鑒定。

1.2.4腓腸肌組織細(xì)胞核中氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(oxidized nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)及NAD+/NADH比率的檢測(cè)：按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5腓腸肌組織細(xì)胞核中Sirt1活性的檢測(cè)：參照試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.6Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：將備用的腓腸肌肌肉組織剪碎和勻漿，離心后測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉和一抗(Sirt1、PGC-1α、FOXO1、P53、mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K、4E-BP1、p-4E-BP1和NAMPT)4 ℃孵育過夜、二抗孵育，將Western熒光混合顯色液與膜蛋白面充分混合，避光孵育1 min。用生物分子成像儀成像，用Image J軟件統(tǒng)計(jì)并分析目的蛋白及內(nèi)參條帶的吸光度比值，數(shù)據(jù)以任意單位(arbitrary units)為單位表示。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1　老年和HLS對(duì)小鼠腓腸肌Sirt1活性的影響

2.1.1histone-H2B、CuZnSOD 和MnSOD在細(xì)胞不同部位的表達(dá)：histone-H2B僅在細(xì)胞核部分蛋白(nuclear protein，NP)表達(dá)，CuZnSOD在總細(xì)胞質(zhì)(total cytosolic protein，total CP)和不含線粒體的細(xì)胞質(zhì)(mitochondrion-free cytosolic protein, mito-free CP)部位表達(dá)，而MnSOD僅在總細(xì)胞質(zhì)，而不在不含線粒體的細(xì)胞質(zhì)部分表達(dá)(圖1)。

圖1　腓腸肌肌細(xì)胞不同部位histone-H2B、CuZnSOD和MnSOD的表達(dá)Fig 1　Expression of histone-H2B, CuZnSOD and MnSOD in different subcellular compartments of gastrocnemius muscles

2.1.2老年和HLS對(duì)小鼠腓腸肌NAD+、NADH和NAD+/NADH比率的影響: AC小鼠腓腸肌組織細(xì)胞核中NAD+的含量較MC小鼠減少46%(P<0.01)；HLS使NAD+的含量在中年和老年小鼠分別減少了51%和63% (P<0.01)。NAD+/NADH比率在AC小鼠也明顯減少(P<0.05)。在中年組和老年組，HLS均明顯減少NAD+/NADH比率(中年組及老年組，P<0.05)(圖2)。

*P<0.05, **P<0.01 compared with middle-aged control; #P<0.05, ##P<0.01 compared with control圖2　老年和HLS對(duì)腓腸肌細(xì)胞核NAD+、NADH及NAD+/NADH比率的影響Fig 2　Effects of age and HLS on NAD+,NADH and NAD+/NADH ratio in myonucleus of

*P<0.05 compared with middle-aged control; #P<0.05, ##P<0.01 compared with control; representative gel bands are shown at the top panel圖3　腓腸肌內(nèi)NAMPT蛋白的表達(dá)Fig 3　Protein expression of NAMPT in gastrocne-

2.1.3老年和HLS對(duì)小鼠腓腸肌NAMPT蛋白表達(dá)的影響: 同MC小鼠相比，AC小鼠腓腸肌肌肉組織中NAMPT蛋白的表達(dá)明顯減少(P<0.05)；HLS可以明顯減少NAMPT蛋白在中年和老年腓腸肌組織中的表達(dá)(中年組，P<0.01;老年組，P<0.05)(圖3)。

2.1.4老年和HLS對(duì)小鼠腓腸肌Sirt1活性的影響: 同MC組相比，AC組腓腸肌組織細(xì)胞核Sirt1的活性明顯降低(P<0.01);在中年組和老年組，HLS均能明顯降低Sirt1的活性(中年組及老年組，P<0.05)(圖4)。

Data were expressed as arbitrary fluorescent units (AFU) per min per microgram of total protein in the gastrocnemius nuclear extracts; *P<0.01 compared with middle-aged control; #P<0.05 compared with control圖4　老年和HLS對(duì)小鼠腓腸肌Sirt1去乙酰化活性的影響Fig 4　Effects of age and HLS on Sirt1 deacetylase activity in gastrocnemius muscles of mice

2.1.5老年和HLS對(duì)小鼠腓腸肌Sirt1蛋白及其下游底物蛋白表達(dá)的影響:同MC組相比，AC組腓腸肌組織細(xì)胞核Sirt1的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，HLS也可以明顯增加中年組和老年組腓腸肌組織細(xì)胞核Sirt1的蛋白(P<0.05)。同Sirt1蛋白的表達(dá)相反，Sirt1的下游底物PGC- 1α、FOXO1和P53的表達(dá)在正常老年小鼠明顯低于中年小鼠(P<0.05)，HLS可以減少這些蛋白在老年和中年腓腸肌組織細(xì)胞核的表達(dá)(P<0.05)(圖5，表1)。

2.2　老年和HLS對(duì)小鼠腓腸肌mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路活性的影響

mTOR及下游底物p70S6K和4E-BP1：AC小鼠與MC小鼠及HLS組與對(duì)照組均無明顯差異。磷酸化的mTOR、 p70S6K和4E-BP1：AC小鼠明顯高于MC小鼠(P<0.05)，HLS組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖6，表2)。

Representative gel bands were shown at the panel圖5　腓腸肌內(nèi)Sirt1及其下游底物PGC- 1α、FOXO1和P53的蛋白表達(dá)Fig 5　Protein expression of Sirt1 and its downstream substrates PGC- 1α, FOXO1 and P53 in gastrocnemius muscles

Representative gel bands were shown at the panel圖6　老年和HLS對(duì)小鼠腓腸肌總的及磷酸化的mTOR、p70S6K及4E-BP1蛋白表達(dá)的影響Fig 6　Effects of age and HLS on total and phosphory- lated protein expression of mTOR, p70S6K and 4E-BP1 in mice gastrocnemius muscles

groupSirt1PGC-1αFOXO1 P53 MC5 500±2 20518 084±1 74615 446±1 58414 926±2 595MS13 395±1 570##5 780±1 829##5 149±1 597##5 467±1 535##AC10 335±1 827*11 586±2 190*9 144±1 681**8 867±1 855*AS14 760±1 201#7 933±1 475#5 000±1 641#5 113±1 435#

Data were expressed as arbitrary units;*P<0.05,**P<0.01 compared with middle-aged control;#P<0.05,##P<0.01 compared with control.

表2　老年和HLS對(duì)小鼠腓腸肌總的及磷酸化的mTOR、p70S6K及4E-BP1蛋白表達(dá)的影響

Data were expressed as arbitrary units;*P<0.05 compared with middle-aged control;#P<0.05,##P<0.01 compared with control.

3　討論

Sirt1廣泛參與老年骨骼肌功能與質(zhì)量衰減的調(diào)節(jié)[5]。在骨骼肌內(nèi)它主要表達(dá)于肌細(xì)胞核，而細(xì)胞核中Sirt1的活性被認(rèn)為與細(xì)胞氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)和線粒體的生物合成與功能密切相關(guān)。本結(jié)果提示老年或HLS使小鼠腓腸肌細(xì)胞核中Sirt1蛋白表達(dá)增加，Sirt1活性降低。有資料顯示隨年齡增加，嚙齒類動(dòng)物骨骼肌中的Sirt1表達(dá)水平增加[6]， Sirt1活性卻降低[5- 6]。目前認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)(即NAD+/NADH比率)、NAD+合成速率及NAD+消耗速率的改變可能導(dǎo)致NAD+濃度年齡依賴性的下降[5- 6]。衰老相關(guān)的NAD+和NAMPT水平下降[6]可能進(jìn)一步導(dǎo)致Sirt1活性減弱，由于機(jī)體的代償機(jī)制，使Sirt1表達(dá)水平增加。Sirt1表達(dá)水平增加與Sirt1活性減弱也有可能與賴氨酸乙?；暗鞍佐驶缴哂嘘P(guān)[6]。在老年萎縮肌肉內(nèi)Sirt1活性而非其蛋白水平可能對(duì)于其下游靶蛋白的功能更為重要[7]。也有研究顯示在HLS 2周后，Sirt1蛋白表達(dá)水平在大鼠跖肌中顯著降低[8]。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)HLS 2周后腓腸肌Sirt1蛋白表達(dá)明顯升高，考慮可能由于肌肉類型、物種及品系等的差異導(dǎo)致了不同的Sirt1蛋白表達(dá)水平。

mTOR信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)在骨骼肌蛋白合成和分解的平衡中發(fā)揮重要作用，而老年或HLS誘發(fā)的肌肉萎縮與骨骼肌蛋白合成和分解的失衡密切相關(guān)。本結(jié)果提示mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性在老年骨骼肌中增加，而在HLS誘導(dǎo)的肌萎縮病理過程中降低。目前認(rèn)為老年較高的mTOR和p70S6K磷酸化水平可能與哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體2信號(hào)通路活性增加及胰島素抵抗有關(guān)[9]。推測(cè)衰老誘導(dǎo)的哺乳動(dòng)物mTOR蛋白過度磷酸化可能對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)合成影響不大。此前有報(bào)道在老年嚙齒類動(dòng)物肌肉中磷酸化mTOR (Ser2448)[10]、p70S6K (Thr389)[10]及4E-BP1(Thr37/46)[11]蛋白表達(dá)水平增加；年輕小鼠經(jīng)HLS兩周后，腓腸肌中磷酸化的p70S6K蛋白表達(dá)水平降低[12]，與本研究結(jié)果類似。

綜上，本結(jié)果表明Sirt1和mTOR直接參與肌肉衰減綜合征小鼠發(fā)病的調(diào)節(jié)，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。