右美托咪定通過Toll樣受體4減輕小鼠肺缺血/再灌注損傷

梁　磊，鄧　林，謝　冕，郭　波

(重慶市中醫(yī)院 麻醉科， 重慶 400020)

肺缺血/再灌注損傷 (lung ischemia/reperfusion injury, LIRI)是指短暫缺血肺組織在恢復(fù)血液再灌注后，功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)功能破壞加重的現(xiàn)象，是影響其移植術(shù)后早期功能恢復(fù)的關(guān)鍵性因素[1]。局部和全身的炎性反應(yīng)是肺缺血/再灌注損傷的主要特征，其相關(guān)機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究[2]。隨著LIRI研究逐步發(fā)展到分子領(lǐng)域，從分子水平研究缺血/再灌注后損傷的病理生理機(jī)制，從而降低組織損傷，已成為當(dāng)前的熱點(diǎn)。

右美托咪定(dexmedetomidine, Dex)是高選擇性ɑ2受體激動(dòng)藥，其在鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛方面的研究已有諸多報(bào)道，對(duì)器官缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚未完全明確[3- 4]。進(jìn)年來研究顯示，Dex可作用多種固有模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor, PRRs)，實(shí)現(xiàn)對(duì)于缺血/再灌注損傷的保護(hù)，但是對(duì)于作用機(jī)制尚需進(jìn)一步深入[5- 6]。本研究即深入探討Dex是如何通過作用PRRs中的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)，達(dá)到肺組織缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：7～8周齡，SPF級(jí)野生型 (WT) C57BL/6和TLR4基因敲除(TLR4-/-) C57BL/6雌性小鼠，體質(zhì)量18～20 g[北京華阜康，No.11401300054426,飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,SYXK(渝)2017-0023]。

1.1.2主要試劑：Dex注射液(2 mL∶200 μg，江蘇恒瑞醫(yī)藥公司)；T-per組織裂解液(Thermo Fisher公司)；4%多聚甲醛(武漢博士德生物工程公司)；SYBR Premix EXTaq RT-PCR 試劑盒(TaKaRa公司)；RSDS-PAGE凝膠試劑盒、彩色蛋白分子預(yù)染Marker、Tublin抗體、HRP-羊抗小鼠和HRP-羊抗大鼠(碧云天生物技術(shù)公司)；熒光定量PCR儀ICYCLERIQ和凝膠成像系統(tǒng)ChemiDoc XRS+(BIO-RAD公司)；小鼠TNF-α、IL- 6和IL- β ELISA試劑盒(eBioscience公司)；小鼠NLRP3一抗(RD公司)。

1.2　方法

1.2.1小鼠分組及處理：采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為4組(n=10)：假手術(shù)組(S組)、肺缺血/再灌注組(I/R組)、0.9% NaCl溶液對(duì)照組(NS組)和Dex組(D組)。腹腔注射水合氯醛(4.5 mg/10 g)麻醉，行倒T型氣管切開術(shù)，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣。沿小鼠左胸骨2、3肋間打開胸腔，暴露左肺，找到肺門后用微型動(dòng)脈夾夾閉30 min，然后松開動(dòng)脈夾恢復(fù)灌注3 h。S組僅開胸不夾閉左肺門；D組和NS組于肺缺血前30 min時(shí)分別腹腔注射Dex 30 μg/kg和等體積0.9% NaCl溶液。

1.2.2肺組織HE染色：取小鼠肺組織，用0.9% NaCl溶液洗凈，固定于4%多聚甲醛48 h后，制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色。

1.2.3RT-qPCR檢測：取實(shí)驗(yàn)小鼠肺組織，用冰0.9% NaCl溶液洗凈，放入含液氮的研缽中，磨至粉末，按每100 mg組織加入1 mL Trizol，對(duì)總RNA抽提純化。將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，配制20 μL RT-qPCR體系，設(shè)置PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min； 95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，循環(huán)40次；熔解曲線測定，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s。引物設(shè)計(jì)見表1。

表1　各組基因引物序列Table 1　Primer sequences of amplication fragments

1.2.4肺組織裂解液的制備：配制組織蛋白裂解液，分別加入10%蛋白酶抑制劑和10%磷酸酶抑制劑。每一份組織加入400 μL左右冰浴的組織蛋白提取液，剪刀剪碎后加入無菌研磨瓷珠10粒，機(jī)械研磨均勻。4 ℃，12 000×g10 min，收集上清液，用于ELISA和蛋白免疫印跡檢測。

1.2.5ELISA檢測TNF-α、IL- 6和IL- 1β水平：采用雙抗夾心法，按ELISA試劑盒說明書分別檢測肺組織裂解液中TNF-α、IL- 6和IL- 1β的含量。使用多功能讀數(shù)儀檢測450 nm下吸光度值。根據(jù)吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)品曲線，計(jì)算樣品的實(shí)際濃度。

1.2.6Western blot檢測NLRP3表達(dá)量：使用BCA法測定組織樣品蛋白濃度，確定上樣量為40 μg，配制12%下層膠和5%上層膠電泳，最后在凝膠成像儀上采集圖片，用Image Lab軟件分析。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1　Dex減輕LIRI

與S組相比，I/R組肺間質(zhì)水腫，中性粒細(xì)胞大量浸潤，肺泡壁顯著增厚，肺泡腔內(nèi)出血明顯。而Dex組較I/R組和NS組炎性細(xì)胞浸潤減少，肺泡腔內(nèi)出血和肺間質(zhì)水腫得到明顯改善(圖1)。

圖1　肺組織HE染色Fig 1　Lung morphology with HE staining(×20)

2.2　Dex抑制肺組織TLR4 mRNA的表達(dá)

與S組相比，I/R組TLR4 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，說明缺血/再灌注可誘導(dǎo)肺組織TLR4基因的大量轉(zhuǎn)錄。但通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)D組顯著低于I/R組和NS組TLR4 mRNA水平(圖2)。

*P<0.01 compared with S group; #P<0.01 compared with I/R group圖2　4組肺組織TLR4 mRNA的表達(dá)Fig 2　TLR4 mRNA in lung tissue of each group

2.3　Dex抑制WT小鼠肺組織前炎性因子的產(chǎn)生

在WT小鼠中，與S組相比，I/R組TNF-α和IL- 6水平顯著上調(diào)，說明肺缺血/再灌注可誘導(dǎo)該部位組織產(chǎn)生大量前炎性因子。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)D組顯著低于I/R組和NS組炎性因子水平(圖3A,B)。然而，在TLR4-/-小鼠中發(fā)現(xiàn)，與S組相比，I/R組TNF-α和IL- 6顯著上調(diào)，但D組與I/R組和NS組無差異(圖3C,D)。

2.4　Dex抑制WT小鼠肺組織中NLRP3炎性小體產(chǎn)生

NLRP3做為NLRs蛋白家族成員，廣泛表達(dá)于DCs和巨噬細(xì)胞，由NLRP3、ASC和無活性的caspase- 1前體組成的復(fù)合體稱為NLRP3炎性小體[7]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與S組相比，I/R組NLRP3和IL- 1β表達(dá)顯著上調(diào)，說明缺血/再灌注可誘導(dǎo)肺組織炎性小體的形成和活化。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)D組兩者水平顯著低于I/R組和NS組(圖4)。

2.5　Dex對(duì)TLR4-/-小鼠肺組織中NLRP3產(chǎn)生無影響

Dex顯著抑制肺組織TLR4轉(zhuǎn)錄和NLRP3炎性小體的形成和活化。有研究報(bào)道，NLRP3可通過TLR4產(chǎn)生，故本研究進(jìn)一步觀察Dex對(duì)于NLRP3的抑制是否通過TLR4介導(dǎo)[8]。使用TLR4-/-小鼠發(fā)現(xiàn)，與S組相比，I/R組NLRP3和IL- 1β表達(dá)顯著上調(diào)，但D組與I/R組和NS組無明顯差異(圖5)。

WT andTLR4-/-C57BL/6 mice veceied LIRI surgery; the levels of TNF-α and IL-6 from lung tissue in WT mice(A and B) andTLR4-/-mice(C and D) were measured ELISA 3 hours after LIRI;*P<0.01 compared with S group;#P<0.01 compared with I/R group

the levels of NLRP3 and IL- 1β(A and B) from lung tissue in WT mice were measured by WB and ELISA 3 hours after LIRI;*P<0.01 compared with S group;#P<0.01 compared with I/R group

3　討論

LIRI常發(fā)生在肺移植、心肺聯(lián)合移植、肺切除術(shù)、肺動(dòng)脈血栓切除術(shù)、體外循環(huán)等臨床工作中。其發(fā)生可造成肺組織功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)功能破壞，嚴(yán)重影響其移植術(shù)后早期功能恢復(fù)[9]。目前認(rèn)為炎性反應(yīng)是LIRI的主要機(jī)制之一， 炎性反應(yīng)引起多種細(xì)胞因子及中性粒細(xì)胞所介導(dǎo)的肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷等[10- 11]。

炎性因子的產(chǎn)生通常由固有免疫系統(tǒng)PRRs的活化激活相關(guān)信號(hào)通路,導(dǎo)致一系列免疫反應(yīng)[12]。重要的PRRs有Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)和NOD樣受體(NOD-like receptors, NLRs)。TLRs是一類天然免疫受體，可以識(shí)別某些病原體或其產(chǎn)物所共有的特定結(jié)構(gòu)[13]。NLRs做為另一類重要的PRRs，參與識(shí)別宿主來源和微生物的損傷相關(guān)分子。NLRP3作為NLRs蛋白家族成員，廣泛表達(dá)于固有免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，由NLRP3、ASC和無活性的caspase- 1前體組成的復(fù)合體稱為NLRP3炎性小體，是內(nèi)源性或外源性危險(xiǎn)信號(hào)的胞質(zhì)內(nèi)感受器，活化caspase- 1，調(diào)控IL- 1β和IL- 18等促炎細(xì)胞因子的成熟和分泌[14]。TLR4活化可誘導(dǎo)大量前炎性因子釋放，尤其是TNF-α和IL- 6，最新研究證實(shí)其也可介導(dǎo)NLRP3炎性小體的形成和活化。

*P<0.01 compared with S group圖5　TLR4-/-肺組織NLRP3和IL- 1β的表達(dá)水平Fig 5　NLRP3 and IL- 1β in TLR4-/- lung n=10)

Dex是高選擇性ɑ2受體激動(dòng)藥，其在鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛方面的研究已經(jīng)有諸多的報(bào)道。本研究建立LIRI模型，使用WT和TLR4-/-小鼠，通過腹腔注射Dex研究其作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在WT小鼠中，Dex可減輕肺缺血/再灌注損傷，阻止肺組織中TLR4基因的轉(zhuǎn)錄，降低前炎性因子的產(chǎn)生，阻斷NLRP3炎性小體的形成和活化。但是在TLR4-/-小鼠中發(fā)現(xiàn)Dex對(duì)于一系列炎性因子的產(chǎn)生沒有影響。說明Dex依賴于TLR4阻斷缺血/再灌注肺組織中前炎性因子的產(chǎn)生和NLRP3炎性小體的形成與活化，從而達(dá)到保護(hù)作用。

炎性反應(yīng)對(duì)于LIRI損傷起重要作用，而炎性反應(yīng)的產(chǎn)生主要通過PRRs[15]。已報(bào)道有多種TLRs受體活化參與該病理過程[6]。但是本研究證明Dex在缺血初期可顯著抑制TLR4的轉(zhuǎn)錄，阻斷了下游信號(hào)通路的傳遞，控制多種前炎性因子的釋放與NLRP3炎性小體的產(chǎn)生，有效保護(hù)了肺組織。

綜上表明，Dex在LIRI中通過降低TLR4表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)，減輕病理損傷，研究結(jié)果為臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。