膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中上皮-間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化機(jī)制研究進(jìn)展*

綜述 審校

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是人類最常見的原發(fā)性惡性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，也是侵襲能力最強(qiáng)的膠質(zhì)瘤。GBM的惡性進(jìn)展和復(fù)發(fā)是其難以治愈的根本原因。目前，GBM尚無有效的治療方法，標(biāo)準(zhǔn)治療包括最大安全范圍手術(shù)切除或診斷性活檢，再行放化療輔助治療。然而，大多數(shù)患者將在1～2年內(nèi)死亡。上皮-間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化（EMT-like）是一個(gè)上皮特性受損而間質(zhì)特性增強(qiáng)的過程，在惡性膠質(zhì)瘤侵襲和遷移過程中發(fā)揮著重要作用［1-3］。因此，探索上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化在GBM侵襲遷移中的作用機(jī)制對(duì)于制定新的有效的治療策略具有重要意義。

1 GBM及GICs概述

膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞（glioma initiating cells，GICs）或膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cells，GSCs）的發(fā)現(xiàn)是膠質(zhì)瘤研究的一個(gè)重要事件，深刻影響了我們對(duì)GBM發(fā)生模式、腫瘤不均一性、腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境關(guān)系以及治療策略的研究［4］。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞又稱膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞（glioma initiating cells，GICs），是一種具有自我更新及無限分化潛能的腫瘤細(xì)胞，同時(shí)具有高度的侵襲遷移能力及致瘤性。GSCs通過自我更新和無限增殖維持著腫瘤細(xì)胞群的生命力；而運(yùn)動(dòng)和遷移能力又使腫瘤細(xì)胞的播散成為可能。GSCs也可以長(zhǎng)時(shí)間處于休眠狀態(tài)并具有多種耐藥分子而對(duì)殺傷腫瘤細(xì)胞的外界理化因素不敏感，是腫瘤進(jìn)展和復(fù)發(fā)過程中的“主角”［5］。

惡性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與腫瘤組織病理及微環(huán)境關(guān)系密切。惡性膠質(zhì)瘤（malignant glioma，MG）的組織學(xué)表現(xiàn)形式為：腫瘤細(xì)胞高度間變、有絲分裂活躍，血管增殖和（或）壞死，腫瘤細(xì)胞呈假柵欄樣圍繞壞死區(qū)并簇集在腫瘤微血管周圍，并向周圍白質(zhì)浸潤(rùn)。既往研究表明，GSCs也集中存在于腫瘤壞死區(qū)周邊、微血管周邊和腫瘤邊緣發(fā)生侵襲的部位，分別稱為缺氧區(qū)微環(huán)境、血管旁微環(huán)境和侵襲性微環(huán)境。GSCs的上述微環(huán)境分布特點(diǎn)提示其與MG的生物學(xué)行為關(guān)系密切，干性表型和功能狀態(tài)可由所處的微環(huán)境動(dòng)態(tài)塑造［6-7］。美國(guó)癌癥基因組圖譜計(jì)劃（the cancer genome atlas，TCGA）基于大樣本膠質(zhì)瘤基因表達(dá)、DNA甲基化模式、信號(hào)通路活性等生物信息學(xué)分析及治療反應(yīng)和生存期，將GBM分為經(jīng)典型（classical）、間質(zhì)型（mesenchymal）、神經(jīng)型（neural）和前神經(jīng)型（preneural）［8］。深入研究發(fā)現(xiàn)，這四種亞型的GBM并非是排他性獨(dú)立存在［9］。同一患者GBM瘤內(nèi)不同微環(huán)境中分布著不同亞型表型的GSCs，如微血管周圍主要分布前神經(jīng)亞型GSCs，而缺氧區(qū)則主要分布著間質(zhì)亞型GSCs［10］，而不同表型GSCs的優(yōu)勢(shì)比例在不同GBM標(biāo)本中也有所不同。利用單細(xì)胞RNA和基因組測(cè)序分析證明，GSCs轉(zhuǎn)錄譜也具有多樣性，進(jìn)一步提示其分子遺傳背景的復(fù)雜和不均一性［11］。

2 EMT及EMT-like概述

在20世紀(jì)60年代后期，Hay等第一次正式提出EMT這一概念，展示了EMT在正常胚胎形成中的重要性，即在原腸胚形成期間上皮來源的細(xì)胞從胚胎的表面進(jìn)入胚胎內(nèi)部，形成中胚層。在20世紀(jì)80年代，Greenburg和Hay描述了成人和胚胎上皮細(xì)胞表型中的EMT。自20世紀(jì)90年代起，越來越多的證據(jù)表明EMT也與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)［12］。GBM中的EMT近些年才逐漸被人們所重視。然而，GBM進(jìn)展期間發(fā)生的并非是完全的EMT，而是類似上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)變過程，稱之為上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化（EMT-like）。它是指一種上皮表型較少并且更加偏向于間質(zhì)表型的狀態(tài)過程，主要表現(xiàn)為上皮標(biāo)志物如E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和緊密連接蛋白1（ZO-1）的表達(dá)下調(diào)并誘導(dǎo)間質(zhì)標(biāo)記物如N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、纖連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）、波形蛋白（Vimentin）和鋅指E盒結(jié)合蛋白1（ZEB1）的升高；從而導(dǎo)致細(xì)胞間粘附能力的減弱及細(xì)胞極性喪失，最終增強(qiáng)了腫瘤的侵襲和遷移能力（圖1）［13］。因此理解GBM進(jìn)展期間EMT的分子調(diào)控機(jī)制將變得更加重要。下文重點(diǎn)從EMT主要信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄因子、miRNA、腫瘤干細(xì)胞、缺氧微環(huán)境、治療抵抗等方面進(jìn)行闡述。

3 主要相關(guān)信號(hào)通路

3.1 TGFβ/Smad

TGFβ與Ⅰ型（TβRⅠ或TGFR1）和Ⅱ型（TβRⅡ或TGFR2）受體結(jié)合時(shí)，激活Smad2和Smad3，然后再與胞質(zhì)內(nèi)的Smad4結(jié)合。Smad三聚體復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合DNA特異位點(diǎn)抑制（如E-cadherin，oc?cludin）或激活（如Snail、Zeb、Twist、FN、Vimentin）靶基因的轉(zhuǎn)錄（圖2）。有趣的是，TGF-β信號(hào)通路不僅激活EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，而且也與這些轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同增加其轉(zhuǎn)錄活動(dòng)［14］。在GBM細(xì)胞系的體內(nèi)體外試驗(yàn)中，TGFβ有潛在誘導(dǎo)EMT的作用，如用TGFβ處理過的U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠通過Smad2信號(hào)通路的誘導(dǎo)發(fā)生間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變、間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力增強(qiáng)［15］。

3.2 Wnt/β-Catenin信號(hào)通路

經(jīng)典的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路是由β-Catenin介導(dǎo)，β-Catenin對(duì)于EMT具有雙重作用，既可作為黏附連接的組成部分，將E-cadherin連接于細(xì)胞骨架，又可以轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核驅(qū)動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄。在不存在Wnt的情況下，糖原合成激酶-3β（GSK-3β）磷酸化β-Catenin并將其靶向泛素化并降解，從而將細(xì)胞質(zhì)β-Catenin維持在低水平。Wnt配體與Frizzled（FZD）受體的結(jié)合導(dǎo)致GSK-3β的抑制，因此阻止了β-Catenin磷酸化并導(dǎo)致其胞質(zhì)內(nèi)的積聚，然后可以進(jìn)入細(xì)胞核并調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)降低鈣黏素介導(dǎo)的黏附能力（圖2）［16］。Wnt/β-Catenin信號(hào)通路已經(jīng)被證明與膠質(zhì)瘤進(jìn)展和患者總生存率的下降密切相關(guān)，并且其在膠質(zhì)瘤EMT中的作用也逐漸被人們所關(guān)注［17］。有研究通過對(duì)30例間質(zhì)型GBM患者的標(biāo)本進(jìn)行評(píng)估顯示W(wǎng)nt/β-Catenin信號(hào)通路被高度激活；此外，這些患者膠質(zhì)瘤細(xì)胞中EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如ZEB1、Twist、Snai和Slug的表達(dá)明顯上調(diào)，最終導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力明顯增強(qiáng)［18］。

?圖2 GBM中涉及EMT的信號(hào)傳導(dǎo)途徑和miRNA的總結(jié)

3.3 轉(zhuǎn)錄因子

在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，這些不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過激活在一些分子量相對(duì)較小的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而協(xié)調(diào)EMT相關(guān)基因的表達(dá)。這些轉(zhuǎn)錄因子統(tǒng)稱為“EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子（EMT-TFs）”，并且可以分為三類不同的蛋白質(zhì)家族：即Snail家族（包括Snail和Slug），ZEB家族（包括ZEB1和ZEB2）和堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)（包括TWIST1、TWIST2和TCF3）家族。EMT的主要調(diào)控因子通過啟動(dòng)子的活化或抑制來控制EMT相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，最終在不同程度上抑制上皮表型相關(guān)基因的表達(dá)如E-cadherin，而上調(diào)間質(zhì)表型相關(guān)基因的表達(dá)包括N-cadherin、FN和Vimentin等（圖2）［19-20］。

在人GBM細(xì)胞系中，體外敲低膠質(zhì)瘤細(xì)胞Snail1通過減少Vimentin并增加E-cadherin的表達(dá)來削弱GBM細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力［21-22］。Slug也參與膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展，因?yàn)槠湓贕BM患者中呈高表達(dá)，與GBM患者的分級(jí)和預(yù)后密切相關(guān)［23］。轉(zhuǎn)錄因子ZEB1在GBM進(jìn)展中起重要作用，并且作為一種致瘤因子與GBM患者的生存期呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)用敲低ZEB1的GBM細(xì)胞原位接種在小鼠顱內(nèi)時(shí)，與空白對(duì)照相比，敲低組腫瘤侵襲能力明顯降低，并且表現(xiàn)出對(duì)替莫唑胺的敏感性增加［24］。ZEB2在GBM患者中呈高表達(dá)并且與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。體外研究發(fā)現(xiàn)，敲低ZEB2能夠增加E-cadherin的表達(dá)，并下調(diào)EMT標(biāo)志物的表達(dá)，如β-catenin、Vimentin、N-cad?herin和Snail，并且削弱膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力［25］。體外實(shí)驗(yàn)提示，敲低Twist1不僅能夠下調(diào)EMT相關(guān)標(biāo)志物如N-cadherin、Vimentin、β-catenin，而且還能降低神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物如Sox2的表達(dá)；同樣，敲低Sox2也能夠下調(diào)Twist1的表達(dá)，提示Twist1和Sox2都能維持膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的干性和誘導(dǎo)EMT［26］。裸鼠原位膠質(zhì)瘤顱內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)提示：過表達(dá)Twist1能夠明顯增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力［27］。

4 EMT與微小RNA（miRNA）

近年來，愈來愈多的研究報(bào)道m(xù)iRNA在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和遷移過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［28］。下文重點(diǎn)對(duì)參與膠質(zhì)瘤EMT過程的部分miRNA進(jìn)行總結(jié)。

miR-200家族由5個(gè)miRNA序列組成，主要通過靶向ZEB家族調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展和EMT（圖2）。對(duì)GBM樣本全基因組miRNA表達(dá)譜的分析表明：miR-200c表達(dá)缺失與ZEB1過表達(dá)密切相關(guān)，提示miR-200c通過ZEB1參與膠質(zhì)瘤的侵襲遷移［29］。另一種靶向ZEB基因的miRNA是miR-590-3p，其在GBM患者組織樣本和GBM細(xì)胞系中的表達(dá)是下調(diào)的。相反，當(dāng)過表達(dá)miR-590-3p時(shí)，其可以通過靶向ZEB1和ZEB2基因抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力［30］。miRNA-203是另一種在GBM中具有重要作用的miRNA，與WHOⅠ/Ⅱ級(jí)GBM患者樣本相比，Ⅲ/Ⅳ級(jí)GBM患者樣本miR-203表達(dá)下調(diào)并且與Slug表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。研究提示miRNA-203靶向Slug抑制膠質(zhì)瘤的EMT，并降低化療抵抗（圖2）；miR-203在伊馬替尼耐藥的GBM細(xì)胞系中表達(dá)明顯下調(diào)，并且這些耐藥細(xì)胞系表現(xiàn)出EMT特點(diǎn)（上皮表型標(biāo)志物如E-cadherin表達(dá)下調(diào)、間質(zhì)表型標(biāo)志物如ZEB1和Vimentin表達(dá)上調(diào)）和侵襲遷移能力明顯增強(qiáng)［31］。

5 EMT與腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）

CSCs被認(rèn)為是腫瘤形成過程的細(xì)胞“驅(qū)動(dòng)器”，現(xiàn)有研究表明：GSCs與膠質(zhì)瘤的高侵襲能力和治療抵抗密切相關(guān)。EMT似乎參與了腫瘤細(xì)胞獲得干性的過程，腫瘤細(xì)胞通過獲得干性，最終導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［32］。最近有研究顯示在GBM細(xì)胞中敲除ZEB1能夠抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞標(biāo)記物SOX2、CD133和OLIG2的表達(dá)，提示EMT與干性之間密切相關(guān)［24］。因此，GSCs有可能通過經(jīng)歷EMT提高侵襲、遷移能力進(jìn)而來促進(jìn)膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展。

另一方面，有研究提示干細(xì)胞能夠釋放細(xì)胞因子和趨化因子來調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展及EMT過程，如通過共培養(yǎng)富含CD133+的膠質(zhì)瘤細(xì)胞與人臍帶血干細(xì)胞（hUCBSC）發(fā)現(xiàn)能夠明顯降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力，并下調(diào)N-cadherin、β-catenin、Vimentin、Twist1和Sox2的表達(dá)，而上調(diào)E-cadherin的表達(dá)［26］。有研究發(fā)現(xiàn)利用大鼠脂肪干細(xì)胞來源的條件培養(yǎng)基能夠誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EMT過程，并明顯增強(qiáng)其侵襲、遷移能力，以及上調(diào)Vimentin、MMP-2、N-cadherin，而降低E-cadherin的表達(dá)［33］。以上研究支持這樣的觀點(diǎn)：即一旦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遠(yuǎn)離腫瘤區(qū)域滲入周圍腦實(shí)質(zhì)，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的干性特征就會(huì)與其間質(zhì)表型特征作出同步的調(diào)節(jié)，并且這種同步調(diào)節(jié)對(duì)于膠質(zhì)瘤的侵襲、遷移至關(guān)重要［12］。

6 EMT與缺氧

缺氧在實(shí)體瘤中經(jīng)常發(fā)生如GBM，主要原因是由于血流量有限，當(dāng)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度超過其血液供應(yīng)，細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)缺氧狀態(tài)［34］。GBM壞死區(qū)域通常被典型的“柵欄樣（pseudopalisading）細(xì)胞”包圍，這些細(xì)胞的特點(diǎn)是均過度表達(dá)HIF-1，是惡性膠質(zhì)腫瘤的標(biāo)志之一［35］。缺氧微環(huán)境誘導(dǎo)人GBM細(xì)胞發(fā)生EMT，主要表現(xiàn)為形態(tài)學(xué)改變、侵襲及遷移能力增強(qiáng)（圖2）。有研究［36］通過用敲低ZEB1的膠質(zhì)瘤細(xì)胞暴露于缺氧條件下時(shí)發(fā)現(xiàn)，空白敲低組膠質(zhì)瘤細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)志物過表達(dá)及侵襲和遷移能力增強(qiáng)，而敲低組間質(zhì)標(biāo)志物未見明顯升高并且侵襲能力顯著減弱，提示ZEB1能夠介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的EMT。有研究［37］發(fā)現(xiàn)用貝伐單抗（bevacizumab）治療的GBM患者標(biāo)本中的間質(zhì)標(biāo)志物MMP2、Zeb1、Zeb2、Snail、Slug和Twist的表達(dá)是上調(diào)的，這些結(jié)果進(jìn)一步表明，抗血管生成療法能產(chǎn)生更加缺氧的環(huán)境，誘導(dǎo)GBM細(xì)胞發(fā)生EMT。

7 EMT與治療抵抗

盡管人們努力尋找不同的分子靶向藥物并聯(lián)合傳統(tǒng)的抗癌療法，對(duì)抗許多類型的腫瘤，但目前無任何療法被證明是完全有效的。GBM標(biāo)準(zhǔn)治療方案包括放療和替莫唑胺（TMZ）化療可能在治療的同時(shí)通過促進(jìn)EMT過程導(dǎo)致腫瘤的惡性進(jìn)展。因此，通過治療腫瘤的同時(shí)發(fā)生EMT可能為GBM復(fù)發(fā)率仍然很高提供了可能的解釋［38］。如ZEB1能夠通過誘導(dǎo)c-MYB、miR-200和MGMT，使人類GBM細(xì)胞發(fā)生TMZ抵抗。甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methyl?guanine-DNA methyltransferase，MGMT）是一種重要的DNA修復(fù)蛋白，還是參與化療耐藥的主要酶，主要受到原癌基因c-MYB的調(diào)控；而miR-200不僅能夠抑制c-MYB，還能抑制ZEB1。當(dāng)用敲低ZEB1的GBM細(xì)胞原位接種在小鼠顱內(nèi)時(shí)并接受TMZ治療，與空白敲低組相比，小鼠存活率明顯增加；體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果支持上述觀點(diǎn)［24］。

8 小結(jié)與展望

綜上所述，GBM中的EMT是一個(gè)由復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的過程，深入研究EMT的分子機(jī)制有助于我們更深刻地認(rèn)識(shí)GBM的發(fā)生發(fā)展和侵襲遷移的過程。近些年，EMT已成為腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，其在GBM侵襲遷移中的作用逐漸被人們所認(rèn)識(shí)、關(guān)注。未來的研究應(yīng)該包括對(duì)EMT標(biāo)志物的經(jīng)典組織學(xué)評(píng)估以及對(duì)腫瘤實(shí)質(zhì)和腫瘤浸潤(rùn)區(qū)基因組分析；若EMT依賴性GBM浸潤(rùn)的理論是真實(shí)的，那么EMT抑制劑聯(lián)合應(yīng)用于惡性膠質(zhì)瘤患者可能會(huì)產(chǎn)生較好的治療效果；治療前的EMT指標(biāo)特征作為常規(guī)診斷工具的一部分，將有助于對(duì)GBM患者微轉(zhuǎn)移形成和多灶性生長(zhǎng)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。對(duì)于那些已經(jīng)發(fā)生EMT的GBM患者則應(yīng)更頻繁地使用MRI或PET監(jiān)測(cè)早期腫瘤播散并接受由EMT抑制劑和經(jīng)典標(biāo)準(zhǔn)治療構(gòu)成的聯(lián)合方案。因此，繼續(xù)探索GBM中EMT過程的分子機(jī)制，將為我們治療GBM提供嶄新的思路。

（2018-02-09收稿）

（2018-04-03修回）