非小細(xì)胞肺癌患者中XAF1的表達(dá)及其臨床意義

王曉燕

(紹興市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，浙江 紹興 312000)

肺癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，而非小細(xì)胞肺癌(non-small celllung cancer, NSCLC)是肺癌最常見(jiàn)的組織學(xué)類(lèi)型，約占肺癌總數(shù)的80%～85%，約75%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期。目前對(duì)于NSCLC患者的治療以手術(shù)聯(lián)合放療、化療和分子靶向治療的綜合治療為主，但5年生存率很低[1]。肺癌的發(fā)生過(guò)程尚不清楚，其中涉及不同基因水平的調(diào)控[2]。X染色體相關(guān)凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein， XIAP)是一種凋亡抑制蛋白，而XIAP相關(guān)因子1(XIAP associated factor 1，XAF1)是新近發(fā)現(xiàn)的XIAP拮抗劑，可抑制XIAP的抗凋亡作用[3-4]。本研究擬探討NSCLC患者中XAF1的表達(dá)，分析XAF1基因的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系，尋求治療NSCLC新的靶標(biāo)。

1　資料和方法

1.1一般資料選擇2013年6月—2016年12月在我院進(jìn)行手術(shù)治療的NSCLC患者60例，其中男34例，女26例，平均年齡41.9±6.5歲；均經(jīng)X線、支氣管鏡、病理學(xué)等檢查確診為NSCLC，術(shù)前無(wú)放化療史，患者無(wú)手術(shù)禁忌癥且患者病例、臨床資料完整，患者均知情同意，并簽署知情同意書(shū)。收集60例NSCLC患者的癌組織標(biāo)本及配對(duì)正常癌旁組織標(biāo)本。

1.2研究方法采用Real-PCR檢測(cè)XAF1基因mRNA的表達(dá)。具體過(guò)程如下：采用TRIzol? Plus RNA Purification Kit(購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司)抽提癌組織和癌旁組織的總RNA，經(jīng)濃度及純度檢測(cè)后反轉(zhuǎn)成cDNA第一鏈，cDNA第一鏈的合成根據(jù)TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix操作說(shuō)明(北京全式金生物有限公司)。根據(jù)NCBI上XAF1基因的基因序列，采用Beacon designer設(shè)計(jì)XAF1基因Real-PCR引物，引物序列: XAF1F：5'-GGGGTACCAGATCTCCTCCCTC-3'； XAF1R：5'-GCTCGAGGTCTCCAGCTGCTTG-3'。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為108 bp,以GAPDH作為參考基因，引物序列：GAPDH-F: 5’-CGACGTAGTCTCATCTGACTT-3’, GAPDH-R: 5’-GTTGCAGTCGACATAATCGTT GA-3’，片段長(zhǎng)度為124 bp，引物均由上海美吉生物有限公司合成。Real-PCR 采用TransStart Top Green qPCR SuperMix(購(gòu)自北京全式金生物有限公司)，Real-PCR反應(yīng)在ABI7500熒光定量PCR儀中進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性2 min, 95℃10 s；56℃20 s；72℃30 s，35cycles，并進(jìn)行溶解曲線的分析，程序?yàn)椋?0℃1 min; 95℃30 s。采用2法計(jì)算癌組織和癌旁組織XAF1基因的相對(duì)表達(dá)量，Ct= Ct(XAF1基因)- Ct(GAPDH基因)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，XAF1基因相對(duì)基因表達(dá)量用(x±s)表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析癌組織和癌旁組織XAF1基因的表達(dá)差異；采用單因素方差檢驗(yàn)分析不同臨床病理特征間XAF1基因的表達(dá)差異；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

XAF1基因及GAPDH基因qPCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，條帶單一，且擴(kuò)增片段長(zhǎng)度與理論大小一致，電泳結(jié)果如圖1所示。Real-PCR反應(yīng)的重現(xiàn)性及精密度良好，如圖2所示。癌組織XAF1基因的表達(dá)量(1.47±0.65)低于癌旁組織XAF1基因的表達(dá)量(2.36±0.89)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.418，P<0.0001)。癌組織XAF1mRNA水平在不同年齡、性別、組織學(xué)類(lèi)型之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高中分化的癌組織XAF1mRNA水平顯著高于低分化的XAF1mRNA水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著TNM分期的增加，XAF1mRNA水平也明顯降低，同時(shí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的XAF1mRNA水平顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見(jiàn)表1。

a.XAF1基因

b.GAPDH基因圖1　qPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2　XAF1基因(I)及GAPDH基因 (II) qPCR擴(kuò)增曲線圖

臨床特征例數(shù)XAF1mRNA水平F/tP年齡(歲)>40281.34±0.56≤40321.59±0.611.6550.1035性別男341.51±0.35女261.49±0.280.24490.8074病理類(lèi)型腺癌211.29±0.79鱗狀細(xì)胞癌391.42±0.560.6990.5084分化程度高中分化331.67±0.28低分化271.26±0.255.918<0.0001分期I171.59±0.34II281.21±0.18III90.76±0.23IV60.66±0.1235.25<0.0001淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有201.03±0.25無(wú)401.68±0.338.679<0.0001

3　討論

NSCLC是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，隨著分子靶向治療技術(shù)和診斷技術(shù)的發(fā)展，NSCLC的治療效果得到了一定的提高，但患者5年生存率仍低于20%，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率仍居高不下。目前關(guān)于NSCLC的發(fā)病機(jī)制并不清楚，探索NSCLC新的腫瘤靶分子一直以來(lái)備受關(guān)注。

人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子3蛋白、高遷移族蛋白B1、卵巢癌構(gòu)域蛋白酶1等多種腫瘤靶分子被認(rèn)為與NSCLC的發(fā)生密切相關(guān)[5-7]。XAF1基因是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)XIAP拮抗蛋白，由301aa組成，其結(jié)構(gòu)域中含有7個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，位于染色體17p13.2位點(diǎn)，在抑癌基因P53的遠(yuǎn)端3cm處。目前的研究指出，XAF1可誘導(dǎo)干擾素的表達(dá)，介導(dǎo)干擾素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡；同時(shí)，XAF1可與XIAP結(jié)合并抑制XIAP的抗凋亡作用[8]。 XAF1基因的失活與黑色素瘤、結(jié)直腸癌、肝癌、胃腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在多種癌組織中呈低表達(dá)水平，XAF1基因的失活也被認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞的耐藥性有關(guān)[9-11]。

本研究應(yīng)用Real-time PCR研究XAF1基因在NSCLC患者癌組織和正常癌旁組織中的mRNA水平的表達(dá)情況，分析XAF1基因的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示XAF1基因在NSCLC患者癌組織的表達(dá)水平明顯低于正常癌旁組織的表達(dá)量，這與原先報(bào)道的XAF1基因在黑色素瘤、結(jié)直腸癌、肝癌、胃腸癌的表達(dá)水平結(jié)果相似[9-10]。進(jìn)一步的分析結(jié)果顯示高中分化的NSCLC癌組織XAF1mRNA水平顯著高于低分化的XAF1mRNA水平，隨著TNM分期的增加，NSCLC癌組織XAF1mRNA水平也明顯降低。同時(shí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC癌組織患者的XAF1mRNA水平顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC癌組織患者，該結(jié)果提示XAF1基因的低表達(dá)可能與促進(jìn)NSCLC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。目前的研究認(rèn)為XAF1的抑癌機(jī)制可能是涉及到XAF1基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島甲基化機(jī)制、XAF1基因位點(diǎn)的雜合性缺失、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)、介導(dǎo)干擾素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、競(jìng)爭(zhēng)性抑制XIAP對(duì)Caspase-3抑制作用以激活Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9的活性[12-13]。具體原因仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，XAF1基因在NSCLC患者中呈低水平表達(dá)，隨著分化程度降低、TNM分期增加及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，XAF1基因的表達(dá)水平也逐漸降低。XAF1基因的低表達(dá)或缺失可能促進(jìn)了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展。