一測(cè)多評(píng)法測(cè)定血塞通膠囊中5種皂苷類成分的含量

姜志遠(yuǎn)，劉世萍，馬妍妍，李業(yè)雨

(1.黑龍江省農(nóng)墾總局疾病預(yù)防控制中心，黑龍江　哈爾濱　150090；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江　哈爾濱　150001)

血塞通膠囊是五加科植物三七藥材經(jīng)煎煮、大孔樹(shù)脂分離獲得的有效成分——三七總皂苷，加入適量的賦形劑制成的膠囊劑。血塞通膠囊具有活血祛瘀、通脈活絡(luò)的功能，臨床上常用于治療中風(fēng)偏癱，心脈瘀阻引起的胸痹心痛、腦梗塞等病癥。為了全面提升藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)血塞通膠囊的多種成分質(zhì)量評(píng)價(jià)，需要大量的化學(xué)對(duì)照品；由于三七皂苷類成分的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)極為相似,分離成本較高，價(jià)格較貴，所以血塞通膠囊多種成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)在實(shí)際生產(chǎn)中很難推廣。本實(shí)驗(yàn)選擇血塞通膠囊中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd為含量指標(biāo), 以價(jià)廉易得的人參皂苷Rg1為參照物, 建立血塞通膠囊皂苷類成分的一測(cè)多評(píng)法[1-2]，實(shí)現(xiàn)5種成分同步測(cè)定, 從而降低檢測(cè)成本, 提高藥品檢驗(yàn)的質(zhì)量和效率,為血塞通膠囊的多指標(biāo)檢測(cè)提供了參考方法和理論依據(jù)。

1　儀器與試劑

1.1　藥品試劑

血塞通膠囊(哈爾濱珍寶制藥有限公司，批號(hào)20170102、20170103、20170104、20170201、20170202、20170203),成分為三七總皂苷,每粒裝0.18 g(含三七總皂苷100 mg)；對(duì)照品三七皂苷R1 (批號(hào)110745-201619)、人參皂苷Rg1(批號(hào)110703-201731)、人參皂苷Re(批號(hào)110754-201626)、人參皂苷Rb1(批號(hào)110704-201726)、人參皂苷Rd(批號(hào)111818-201001)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈(色譜純，Merck公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.2　儀器設(shè)備

Agilent 1100型高效液相色譜儀，配有四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器；SHIMADZU LC-2010AHT型液相色譜儀(日本島津)；YMC-Pack C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱、Phemomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱、Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；BS210S型電子天平 (北京賽多利斯天平有限公司)；KQ-600型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q A10型超純水系統(tǒng)(默克密理博公司)。

2　方法與結(jié)果

2.1　一測(cè)多評(píng)方法學(xué)考察

2.1.1色譜條件[3-5]

YMC-Pack C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-水, 梯度洗脫(0～25 min,20%乙腈；25～50 min,20%～46%乙腈；50～60 min,46%～55%乙腈；60～65 min,55%乙腈) ；流速1.5 ml/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；進(jìn)樣量10 μl。皂苷的混合對(duì)照品和血塞通膠囊的HPLC圖見(jiàn)圖1。

圖1　皂苷混合對(duì)照品(A)和血塞通膠囊(B)HPLC圖

2.1.2皂苷混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd等5種對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 ml中含0.304 5 mg三七皂苷R1、1.193 6 mg人參皂苷Rg1、0.206 4 mg人參皂苷Re、1.532 4 mg人參皂苷Rb1、0.297 8 mg人參皂苷Rd的皂苷混合溶液，即得。

2.1.3供試品溶液的制備

取血塞通膠囊內(nèi)容物約0.6 g，精密稱定，置100 ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理(功率400 W，頻率40 kHz)20 min，放置至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4線性關(guān)系考察

取“2.1.2項(xiàng)”下的皂苷混合對(duì)照品溶液，分別精密吸取2、4、6、8、10、12、15、20 μl，按“2.1.1項(xiàng)”下色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。5種皂苷的線性考察結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　血塞通膠囊中5種皂苷成分的線性關(guān)系

2.1.5精密度試驗(yàn)

精密吸取10 μl“2.1.2項(xiàng)”下的皂苷混合對(duì)照品溶液，按“2.1.1項(xiàng)”下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄5種皂苷類成分的峰面積,結(jié)果5種成分峰面積的RSD值分別為0.09%,0.11%,0.24%,0.17%,0.08%,表明儀器精密度良好。

2.1.6溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品，按“2.1.3項(xiàng)”下的制備方法制備供試品溶液，室溫放置，在0 h、2.5 h、5 h、7.5 h、10 h、12.5 h、15 h、20 h、25 h分別進(jìn)樣10 μl，記錄5種皂苷類成分峰面積。結(jié)果表明，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd等5種皂苷成分峰面積的RSD值分別為0.44%，0.26%，0.86%，0.71%和0.23%，表明血塞通膠囊供試品溶液在25 h內(nèi)的峰面積沒(méi)有明顯的變化，檢測(cè)成分的穩(wěn)定性良好，能夠滿足含量測(cè)定的需要。

2.1.7重復(fù)性試驗(yàn)

取本品，按“2.1.3項(xiàng)”下的方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.1項(xiàng)”下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定5種皂苷類成分的含量。結(jié)果表明，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd等5種皂苷類成分的含量分別為44.32 mg/g，172.94 mg/g，19.61 mg/g，165.87 mg/g和42.54 mg/g, RSD值分別為0.83%，0.97%，0.94%，1.05%和0.97%, 結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.8加樣回收率試驗(yàn)

取血塞通膠囊內(nèi)容物約0.3 g，精密稱定6份，置100 ml量瓶中，分別精密加入等量的皂苷混合對(duì)照品, 加入甲醇適量，按“2.1.3項(xiàng)”下方法制備供試品溶液。依法測(cè)定5種皂苷成分的含量并計(jì)算平均回收率。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd等5種檢測(cè)成分的平均回收率分別為101.96%，101.97%，101.28%，100.77%，101.35%；RSD值分別為0.35%，0.21%，0.20%，0.31%，0.17%，說(shuō)明該方法的回收率較高，具有良好的準(zhǔn)確度。

2.2　待測(cè)成分的相對(duì)校正因子

取“2.1.2項(xiàng)”下的皂苷混合對(duì)照品溶液，按“2.1.1項(xiàng)”下的色譜條件分別進(jìn)樣2、5、10、15、20、30 μl,測(cè)定5種皂苷類成分的峰面積。以人參皂苷Rg1為參照物,根據(jù)公式Fr=(An×Ws)/(As×Wn)分別計(jì)算三七皂苷R1、人參皂苷Re、Rb1、Rd等4種待測(cè)成分的相對(duì)校正因子,式中Fr、An、Ws、As、Wn分別為相對(duì)校正因子、參照成分的峰面積及其質(zhì)量濃度(mg/ml)、待測(cè)成分的峰面積及其質(zhì)量濃度(mg/ml)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　血塞通膠囊中4種待測(cè)成分的相對(duì)校正因子計(jì)算結(jié)果表

2.3　校正因子的重復(fù)性考察

2.3.1不同檢測(cè)儀器對(duì)相對(duì)校正因子的影響

考察Agilent 1100 、SHIMADZU LC-2010AHT等兩種型號(hào)的液相色譜儀以及YMC-Pack C18、Phenomenon C18、Luna C18(規(guī)格均為250 mm×4.6 mm,5 μm)等3種色譜柱對(duì)血塞通膠囊的5種皂苷類成分相對(duì)校正因子的影響。結(jié)果表明，待測(cè)成分在不同色譜系統(tǒng)和色譜柱下的相對(duì)校正因子比較接近(RSD<3%)，重現(xiàn)性良好。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.2待測(cè)成分色譜峰的定位

采用人參皂苷Rg1的保留時(shí)間相對(duì)值作為待測(cè)成分的定位標(biāo)準(zhǔn), 計(jì)算不同色譜儀和色譜柱的相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果表明，在不同的色譜儀和色譜柱下，待測(cè)成分相對(duì)保留時(shí)間的數(shù)值比較接近(RSD<3%), 重現(xiàn)性較好。結(jié)果見(jiàn)表4。

表3　不同色譜儀和色譜柱測(cè)得的相對(duì)校正因子

表4　不同色譜儀和色譜柱測(cè)得的相對(duì)保留時(shí)間

2.4　樣品的含量測(cè)定

按設(shè)定的含量測(cè)定方法，用一測(cè)多評(píng)法 (QAMS) 與外標(biāo)法 (ESM)同時(shí)測(cè)定6批血栓通膠囊樣品中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的含量，分別計(jì)算血塞通膠囊中5種皂苷類成分的含量。結(jié)果表明，兩種含量測(cè)定方法測(cè)得的含量數(shù)據(jù)無(wú)顯著差異(RSD<3%) 。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　血塞通膠囊中5種皂苷成分的含量測(cè)定比較結(jié)果表(mg/g)

3　討論

3.1　色譜系統(tǒng)的選擇

本實(shí)驗(yàn)參考了2015年版《中國(guó)藥典》三七總皂苷的含量測(cè)定及參考文獻(xiàn)[6-8]中皂苷類成分含量測(cè)定的方法,考察了甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水(磷酸溶液)系統(tǒng)等兩種流動(dòng)相體系對(duì)血塞通膠囊的分離效果, 結(jié)果顯示乙腈-水系統(tǒng)的分離效果較好, 獲得的HPLC圖譜的基線平穩(wěn)，色譜峰較多, 峰形較好，尤其是人參皂苷Rg1和Re可以達(dá)到基線分離，因此選擇了乙腈-水系統(tǒng)。

3.2　不同色譜溫度對(duì)相對(duì)校正因子的影響

本實(shí)驗(yàn)比較了不同的柱溫(30℃、35℃、40℃)對(duì)相對(duì)校正因子的影響, 結(jié)果人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd等4種待測(cè)成分相對(duì)校正因子的RSD<1%, 表明相對(duì)校正因子對(duì)不同柱溫的耐用性良好。