HMGB1介導(dǎo)的炎癥通路在雷公藤致大鼠肝損傷中的作用研究

董捷鳴 章從恩 于小紅 吳昊 馬致潔 趙奎君

中圖分類號 R965.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）05-0633-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.05.14

摘 要 目的：研究高遷移率族蛋白B1（HMGB1）介導(dǎo)的炎癥通路HMGB1-Toll樣受體4（TLR4）/核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）在雷公藤致大鼠肝損傷中的作用，為闡明雷公藤致肝損傷的作用機(jī)制提供參考。方法：將24只SD大鼠隨機(jī)分為空白組（生理鹽水，灌胃）、雷公藤組（以生藥計(jì)16 g/kg，灌胃）和中和劑組（腹腔注射100 mg/kg甘草酸銨溶液3 h后再灌胃以生藥計(jì)16 g/kg的雷公藤），每組8只，各組大鼠均連續(xù)給藥3周。每周給藥后均檢測大鼠血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平；給藥結(jié)束后，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清中HMGB1、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、IL-2、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平，Western blot法檢測大鼠肝組織中HMGB1、NF-κB p65、TLR4蛋白表達(dá)，蘇木精-伊紅染色后觀察大鼠肝組織病理學(xué)改變。結(jié)果：給藥3周后，雷公藤組大鼠血清中AST、ALT、HMGB1、IL-1β、IL-2、TNF-α水平以及肝組織中HMGB1、NF-κB p65、TLR4蛋白表達(dá)水平均顯著高于空白組和中和劑組（P<0.05或P<0.01）。雷公藤組大鼠肝組織中央靜脈周圍肝細(xì)胞水腫，部分肝細(xì)胞漿內(nèi)可見圓形空泡；中和劑組大鼠僅少量細(xì)胞內(nèi)可見大小不一的空泡。結(jié)論：雷公藤致大鼠肝損傷的機(jī)制可能與其激活了HMGB1-TLR4/NF-κB炎癥通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 雷公藤；肝損傷；高遷移率族蛋白1；Toll樣受體4；核轉(zhuǎn)錄因子κB；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of high-mobility group box 1 protein （HMGB1）-mediated inflammatory pathway HMGB1-Toll like receptor 4 （TLR4）/nuclear transcription factor κB（NF-κB）on liver injury of rats induced by Tripterygium wilfordii， and to provide reference for clarify the mechanism of liver injury induced by T. wilfordii. METHODS： Totally 24 SD rats were randomly divided into blank group （normal saline， i.g.）， T. wilfordii group （16 g/kg by crude drug， i.g.） and neutralizer group （16 g/kg T. wilfordii crude drug i.g. after i.p injection of 100 mg/kg Ammonium glycyrrhizinate solution 3 h）， with 8 rats in each group. All rats were treated for consecutive 3 weeks. The serum levels of AST and ALT in rats were detected every week. After the end of medication， the serum levels of HMGB1， IL-1β， IL-2 and TNF-α were detected by ELISA method； the protein expression of HMGB1， NF-κB p65 and TLR4 in liver tissue of rats were detected by Western blot assay. The pathological changes of liver tissue in rats were measured with HE staining method. RESULTS： After 3 weeks of treatment， the serum levels of AST， ALT， HMGB1， IL-1β， IL-2 and TNF-α in rats， the protein expression of HMGB1， NF-κB p65 and TLR4 in liver tissue of rats in T. wilfordii group were significantly higher than blank group and neutralizer group （P<0.05 or P<0.01）. Hepatocyte edema was found around the central vein of the liver， and circular vacuoles were seen in some hepatic cytoplasm in T. wilfordii group； only varying size of vacuoles were found in a small number of cells in neutralizer group. CONCLUSIONS： T. wilfordii induced liver injury may be associated with the activation of HMGB1-TLR4/NF-κB inflammation pathway.

KEYWORDS Tripterygium wilfordii； Liver injury； High-mobility group box 1 protein； Toll like receptor 4； Nuclear transcription factor κB； Rats

雷公藤為衛(wèi)矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.F.的干燥根莖，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]。雷公藤在治療自身免疫性疾?。ㄈ珙愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡）上有顯著且獨(dú)特的療效[2-3]，但其對肝、腎以及生殖器官具有一定毒性，在傳統(tǒng)中藥中毒性名列前位[4-5]，從而制約了其臨床應(yīng)用。目前研究認(rèn)為，雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤生物堿等是雷公藤致毒的主要成分[6-7]。筆者前期對雷公藤肝毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)也進(jìn)行了相關(guān)研究[8-9]，證實(shí)了雷公藤甲素、雷公藤紅素可能是雷公藤致肝損傷的關(guān)鍵成分，且發(fā)現(xiàn)雷公藤致肝損傷后炎癥因子[白細(xì)胞介素1（IL-1）、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）]水平升高。而IL-1、IL-6、TNF-α是高遷移率族蛋白B1（HMGB1） 引起肝臟炎癥損傷的主要下游炎癥因子[10-12]。故筆者推測由HMGB1介導(dǎo)的炎癥通路HMGB1-Toll樣受體4（TLR4）/核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）可能是雷公藤致肝損傷的關(guān)鍵通路。有報(bào)道顯示，甘草酸銨能有效抑制HMGB1表達(dá)[13]。故在本研究中筆者選用甘草酸銨為HMGB1抑制劑，抑制HMGB1-TLR4/NF-κB通路激活，觀察肝組織炎癥發(fā)生情況以及通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，為更好地了解雷公藤致肝損傷的機(jī)制以及更有針對性地選擇減輕雷公藤肝毒性的方法提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Epoch酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；PL-203電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Neofuge 15R臺式高速冷凍離心機(jī)（香港力康生物醫(yī)療控股有限公司）；Chemray 240全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技有限公司）；5424R離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；CKX41光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥材與試劑

雷公藤藥材于2016年1月采自福建三明市，經(jīng)北京友誼醫(yī)院中藥劑科主任趙奎君教授鑒定為矛科植物雷公藤的干燥根莖；甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)品（美國Sigma公司，批號：101843996，純度：≥95%）；大鼠HMGB1試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號：AK0017CT13009）；大鼠IL-1β、IL-2酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（湛江科聯(lián)生物科技有限公司，批號：221070422、221070411）；大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（美國eBioscience公司，批號：4331720）；兔HMGB1一抗、大鼠TLR4一抗（賽維爾生物科技有限公司，批號：03517061401、177224）；大鼠NF-κB p65一抗（美國CST公司，批號：06/2017）；山羊抗兔鼠通用二抗（丹麥Dako公司，批號：20039581）；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒（批號：2017007）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒（批號：201700）均購自長春匯力公司；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

SPF級SD大鼠24只，♂，4～5周齡，體質(zhì)量（200±20） g，由華阜康生物科技股份有限公司提供（動物合格證號：11401300054115）。購入后將大鼠分籠飼養(yǎng)于北京友誼醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級實(shí)驗(yàn)室，每籠4只，飼養(yǎng)期間維持室內(nèi)溫度為25 ℃、相對濕度約為50%、12 h晝夜燈光交替。飼料為實(shí)驗(yàn)室提供的大鼠專用飼料，每周換籠清潔2次。

2 方法

2.1 溶液的制備

（1）雷公藤溶液：稱取打碎成1～2 cm碎塊的雷公藤2 500 g，分批煎煮，先加入8倍量水提前浸泡30 min，然后煎煮30 min，用孔徑為0.25 cm藥篩過濾，收集濾液，藥渣再加入8倍水煎煮30 min，同等條件過濾，合并2次濾液。最后將所得濾液濃縮成以生藥量計(jì)為1.6 g/mL的藥液，備用。（2）甘草酸銨溶液：精密稱取甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)品15 g，加生理鹽水制備成100 mg/mL溶液，超聲使其充分溶解，備用。

2.2 分組與給藥

將24只大鼠隨機(jī)分為空白組（生理鹽水，灌胃）、雷公藤組（以生藥計(jì)16 g/kg，灌胃）[9]、中和劑組（腹腔注射100 mg/kg甘草酸銨3 h后再灌胃以生藥計(jì)16 g/kg的雷公藤溶液）[14]，每組8只。3組大鼠均連續(xù)灌胃3周，期間正常飲食飲水。

2.3 血清中AST、ALT含量檢測

每周給藥后對大鼠尾靜脈取血，將血液靜置2 h，以845×g離心10 min，取上清，采用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中AST、ALT含量。

2.4 血清中HMGB1、IL-1β、IL-2、TNF-α水平檢測

末次給藥后，大鼠禁食不禁水12 h，然后腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，采用促凝采血針于下腔靜脈取血，常溫靜置2 h，845×g離心10 min，取上清，-80 ℃冰箱中保存，備用。采用ELISA法檢測血清中HMGB1、IL-1β、IL-2、TNF-α水平，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.5 大鼠肝組織病理學(xué)觀察

將大鼠處死后取肝組織，分離肝右上葉，以4%甲醛溶液固定，經(jīng)過脫水、石蠟包埋、切片（厚度4 μm）、蘇木精-伊紅（HE）染色、透明、封片等步驟后，在200倍顯微鏡下拍照分析，觀察大鼠肝組織病理學(xué)變化。

2.6 肝組織中HMGB1、NF-κB p65、TLR4蛋白表達(dá)水平檢測

采用Western blot法檢測大鼠肝組織中HMGB1、NF-κB p65、TLR4蛋白表達(dá)。取剩余肝組織剪成小塊，加入蛋白裂解液后置于勻漿器中勻漿處理，用移液器將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，振蕩，冰浴30 min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解，然后以12 000×g離心10 min，收集上清（即總蛋白溶液）。取6.0 μL蛋白溶液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳（濃縮膠電壓為75 V，分離膠為120 V），轉(zhuǎn)膜，加入一抗（HMGB1和TLR4稀釋比例均為1 ∶ 1 000，NF-κB p65稀釋比例為1 ∶ 500），4 ℃孵育過夜，用TBST緩沖液清洗3次，每次5 min；然后加入二抗（1 ∶ 3 000），室溫下孵育30 min后，用TBST緩沖液清洗3次，每次5 min；然后再經(jīng)過化學(xué)發(fā)光等步驟得到凝膠圖像，采用alphaEaseFC灰度分析軟件檢測條帶灰度值，最終結(jié)果以目的條帶與內(nèi)參β-肌動蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值表示各蛋白表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以x±s的形式表示，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血清中ALT、AST含量檢測結(jié)果

雷公藤組大鼠在給藥2周后血清中ALT、AST含量顯著高于空白組（P<0.05或P<0.01），并且給藥2周后血清中AST含量以及給藥3周后血清中ALT、AST含量均顯著高于中和劑組，然而中和劑組大鼠在給藥不同時間后血清中ALT、AST含量與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），結(jié)果見表1。

3.2 血清中炎癥因子檢測結(jié)果

與空白組比較，雷公藤組大鼠血清中HMGB1、IL- 1β、IL-2、TNF-α水平均顯著升高（P<0.01），且顯著高于中和劑組（P<0.05或P<0.01），結(jié)果見表2。

3.3 肝組織病理學(xué)觀察結(jié)果

空白組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰完好。雷公藤組大鼠肝組織中央靜脈周圍肝細(xì)胞水腫，細(xì)胞腫脹、淡染（如黑色箭頭所示）；血管內(nèi)皮疏松，內(nèi)皮輕度增生（如灰色箭頭所示）；肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)清晰，肝竇輕度擴(kuò)張，部分肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見圓形空泡（如白色箭頭所示）。中和劑組大鼠肝組織匯管區(qū)可見細(xì)胞增生及單核細(xì)胞浸潤（如黑色箭頭所示）；肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)尚清晰，少量肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見大小不一的圓形空泡（如白色箭頭所示），病理切片圖見圖1。

3.4 肝組織中HMGB1、NF-κB p65、TLR4蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果

與空白組比較，雷公藤組大鼠肝組織中HMGB1、NF-κB p65、TLR4蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），且高于中和劑組（P<0.05或P<0.01），蛋白測定電泳圖見圖2，蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果見表3。

4 討論

ALT、AST是評價肝臟功能及肝臟損傷的常見檢測指標(biāo)[15]；而IL-1β、IL-2、TNF-α為炎癥反應(yīng)的敏感指標(biāo)，特別是TNF-α在免疫炎癥反應(yīng)中占有重要地位[13，16]。本研究結(jié)果顯示，加入雷公藤后大鼠血清中ALT、AST含量及炎癥因子IL-1β、IL-2、TNF-α水平顯著升高，再結(jié)合病理學(xué)觀察結(jié)果分析，可見本研究成功復(fù)制了雷公藤致肝損傷大鼠模型。

HMGB1-TLR4/NF-κB炎癥通路在諸多炎癥反應(yīng)中占據(jù)重要地位，HMGB1與TLR4受體結(jié)合后形成內(nèi)或外源性復(fù)合物，再結(jié)合NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，引起下游炎癥因子（如IL-2、IL-6等）的產(chǎn)生，這些炎癥因子進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞損傷后釋放HMGB1，形成炎癥正反饋調(diào)節(jié)，引起炎癥反應(yīng)級聯(lián)化擴(kuò)大，加重炎癥反應(yīng)。與雷公藤組比較，中和劑組大鼠肝組織中HMGB1、NF-κB p65、TLR4蛋白表達(dá)水平及血清中HMGB1水平均顯著降低，提示甘草酸銨成功地抑制了HMGB1生成，進(jìn)而抑制了HMGB1- TLR4/NF-κB通路的激活。且在此炎癥通路的激活被抑制后，AST、ALT和血清炎癥因子IL-1β、IL-2、TNF-α的水平均降低，肝組織HE染色結(jié)果亦顯示肝損傷程度減輕。可見，抑制HMGB1-TLR4/NF-κB炎癥通路后肝組織炎癥反應(yīng)及損傷確實(shí)減輕，提示HMGB1-TLR4/NF-κB炎癥通路極有可能是雷公藤致大鼠肝損傷的關(guān)鍵炎癥通路。但是中和劑組大鼠炎癥反應(yīng)雖然減輕，但并未達(dá)到與空白組相同的水平，并且肝組織中TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平較空白組顯著升高（P<0.05），這提示可能還有其他原因激活了TLR4/NF-κB炎癥通路，即還可能存在其他能夠與TLR4受體結(jié)合且引起肝損傷炎癥通路的蛋白，具體原因還需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究證實(shí)了HMGB1-TLR4/NF-κB炎癥通路在雷公藤致大鼠肝損傷中的作用，這為有針對性的雷公藤減毒研究提供了方向與思路。

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（收稿日期：2017-09-25 修回日期：2017-11-30）

（編輯：林 靜）