青梅酵素的生物活性 及體外抑菌作用

王 輝,馬秀敏,張 鷹

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院,廣東廣州 510550)

青梅,又稱為果梅、酸梅,是梅子中的一種[1]。青梅營(yíng)養(yǎng)豐富,含有多酚、黃酮、粗纖維、維生素、鐵、鋅、磷 以及豐富的氨基酸[2]。研究表明,青梅原汁具有促進(jìn)血液中乳酸外排和清潔血液的作用[3];具有較強(qiáng)的抗氧化作用,可抑制脂質(zhì)過氧化物對(duì)膜結(jié)構(gòu)的損傷,保護(hù)肝臟[4];且具有較強(qiáng)的抑制微生物的作用[5]。但青梅低糖高酸,還有苦杏仁苷導(dǎo)致的難以忍受的苦澀味,不宜鮮食,是典型的加工型水果[6-7]。因此,青梅被加工成多種產(chǎn)品,包括鹽漬類產(chǎn)品、蜜餞類制品、梅飲料制品、梅酒類制品、養(yǎng)生梅醋等。

酵素食品是指以一種或多種新鮮蔬菜、水果、菌菇、藥食同源中草藥等為原料,經(jīng)多種有益菌發(fā)酵而成的功能性產(chǎn)品,含有豐富的酶、維生素、礦物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物等營(yíng)養(yǎng)成分[8],具有平衡機(jī)體作用、消炎抗菌、美白抗衰老、解酒等生理功能[9]。目前國內(nèi)對(duì)酵素的研究處于起步階段,研究報(bào)道相對(duì)較少[10]。

將青梅加工成青梅酵素,可以擴(kuò)大對(duì)青梅的利用,豐富酵素產(chǎn)品。但目前,國內(nèi)外未有對(duì)青梅酵素的研究報(bào)道。本文以青梅在自然狀態(tài)下發(fā)酵制得的青梅酵素為研究對(duì)象,對(duì)其抗氧化能力、酶活力和抑菌活性進(jìn)行研究,為評(píng)估青梅酵素功能和開發(fā)青梅酶素產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青梅酵素 廣東省廣州市從化地區(qū)出產(chǎn)的大肉梅在自然條件下發(fā)酵半年制得;金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),大腸桿菌(Escherichiacoli),枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,瓊脂15～20 g,水1000 mL,pH7.0～7.2,121 ℃滅菌30 min);四水合鉬酸銨、鄰菲咯啉等 均為分析純;橄欖油 市售。

THZ-82型水浴恒溫振蕩器 金壇市中大儀器廠;800B型低速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;SHZ-D(Ⅲ)型生化培養(yǎng)箱 韶關(guān)市科力實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;PYX-280S-A型超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;722N型可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;BOI-DL型單道可調(diào)移液器 上海寶予德科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 青梅酵素抗氧化活性測(cè)定

1.2.1.1 總抗氧化能力測(cè)定 采用鉬酸銨法[11]。配制鉬酸銨反應(yīng)體系:分別取2.13 g Na3PO4、0.99 g鉬酸銨、6.67 mL濃硫酸定溶于200 mL超純水中,混合均勻。配制一定濃度梯度的待測(cè)溶液以及0～120 μg/mL的VC溶液。取3 mL鉬酸銨反應(yīng)試劑加入0.3 mL的待測(cè)酵素中,充分混合后置于95 ℃水浴加熱90 min,冷卻至室溫,在波長(zhǎng)為695 nm下測(cè)定其吸光值,用不加樣液的空白試劑調(diào)零。被測(cè)酵素的總抗氧化能力以抗壞血酸當(dāng)量進(jìn)行表示。

1.2.1.2 對(duì)羥基自由基(·OH)清除作用測(cè)定 參考李杰等[12]的方法。取1 mL的0.75 mmol/L鄰菲咯啉、3.8 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4,0.2 mol/L)以及1.5 mL的0.75 mmol/L硫酸亞鐵混勻,然后加入1 mL樣品液與1 mL 0.01% H2O2到該混合試劑當(dāng)中,在37 ℃恒溫反應(yīng)60 min,與536 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值,以VC代替樣品作陽性對(duì)照?！H清除率按下式計(jì)算。

式中:A1-樣液的吸光值;A2-不加樣液的吸光值,樣液以蒸餾水代替;A3-不加H2O2和樣液的吸光值,H2O2和樣液以蒸餾水代替。

1.2.1.3 對(duì)DPPH自由基(DPPH·)清除能力測(cè)定 參照范金波等[13]的方法。稱取DPPH20 mg,用無水乙醇定容至250 mL,制得200 mmol/L的DPPH工作液。用蒸餾水將酵素稀釋成不同濃度。取1 mL樣品液和3 mL DPPH工作液于試管中振蕩搖勻。在室溫下,靜置反應(yīng)30 min。在517 nm處測(cè)定吸光值。

式中:Ai-1 mL樣品液與3 mLDPPH液的吸光值;Aj-1 mL樣品液與3 mL無水乙醇的吸光值;Ac-1 mL無水乙醇與3 mL DPPH的吸光值。

1.2.1.4 還原力測(cè)定 以VC作為參照,取1 mL不同濃度的樣品液和2.5 mL pH6.6,0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液、2.5 mL濃度為1% K3Fe(CN)6振蕩,混合均勻。在50 ℃反應(yīng)20 min,立即加入2.5 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)。取2.5 mL上述反應(yīng)液和2.5 mL超純水、0.5 mL 0.1% FeCl3振蕩混合,靜置反應(yīng)10 min,在700 nm處測(cè)其吸光值[14]。

1.2.2 青梅酵素酶活力測(cè)定 將青梅酵素在4000 r/min、6 ℃條件下離心10 min,取上清液。以體積比為7∶13加入飽和硫酸銨,于4 ℃條件下鹽析2 h,取上清液,備用[15]。

1.2.2.1 青梅酵素中脂肪酶活力測(cè)定參考Benjakul S等[16]的方法。規(guī)定1 mL酶液,于40 ℃,pH7.5條件下,水解脂肪每分鐘產(chǎn)生1微摩爾的脂肪酸即為一個(gè)脂肪酶國際單位,以U/mL表示。

配制2%青梅酵素,以0.025 mol/L,pH7.5磷酸緩沖溶液為溶劑。量取4%PVA溶液加入50 mL橄欖油,用勻漿機(jī)處理9 min(分3次進(jìn)行,每次3 min,間隔5 min),即獲得乳白色的PVA乳化液。分別加4 mLPVA乳化液和5 mL磷酸緩沖溶液于A、B錐形瓶中。在往A瓶加入15 mL95%乙醇。于40 ℃水浴5 min后各加入1 mL樣品液混勻。在40 ℃水浴反應(yīng)15 min,再往B瓶加入15 mL95%乙醇。用0.005 mol/L NaOH滴定,記錄其消耗體積,計(jì)算脂肪酶的活力。公式如下:

式中:X-樣品液的酶活力;B-滴定樣品所需NaOH體積,mL;A-滴定空白組時(shí)所需NaOH體積,mL;c-NaOH的濃度,mol/L;0.05為NaOH濃度換算系數(shù);50為0.05 mol/L NaOH溶液1.00 mL;相當(dāng)于脂肪酸50 μmol;1/15為反應(yīng)時(shí)間15 min,以1 min計(jì);n為稀釋倍數(shù)。

1.2.2.2 青梅酵素中SOD活力測(cè)定 運(yùn)用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定。按照表1試管加入Tris-HCI緩沖液(內(nèi)含EDTA)和超純水,在25 ℃預(yù)熱20 min,取出。加入鄰苯三酚(已25 ℃預(yù)熱20 min),立即搖勻并在波長(zhǎng)為325 nm下每30 s測(cè)定吸光值,記為A0。

測(cè)定酵素的吸光值參照表1,但預(yù)熱20 min后先加入0.5 mL超純水配制的不同濃度的青梅酵素再加入鄰苯三酚。超純水的使用量相應(yīng)減少0.5 mL。測(cè)定其吸光值,記為ASOD。公式如下:

表1 鄰苯三酚測(cè)定自氧化速率加樣表Table 1 Pyrogallic acid determin autoxidation rate Sample list

式中:V1-反應(yīng)液總體積,mL;V2-測(cè)定樣品體積,mL;ΔA0-鄰苯三酚的自氧化速率;ΔASOD-樣品OD值變化速率;n-稀釋倍數(shù)。

1.2.2.3 青梅酵素中蛋白酶活力測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:參照國標(biāo)GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑》制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照表2操作加入試劑后,振蕩搖勻,40 ℃水浴加熱20 min于680 nm處測(cè)其吸光值,以不含酪氨酸的空白管為空白。以吸光值為y軸,L-酪氨酸的濃度為x軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

灌區(qū)內(nèi)兩個(gè)氣象站計(jì)算得到的春玉米日需水量變化過程和高度一致。計(jì)算得到春玉米生育期內(nèi)總需水量約為510 mm，該值與趙春林在充分供水條件下（灌水量261～304 mm）得到的春玉米耗水量505.5～506.2 mm一致[15]。在春玉米總需水量中，苗期、生長(zhǎng)期、開花灌漿期和成熟期的需水量分別占總需水量的15%、38%、3%6和11%，各階段的日需水量分別約為2.4 mm/d、3.9 mm/d、4.3 mm/d和2.3 mm/d，生育期日需水量為3.3 mm/d?？梢钥闯?，作物需水最關(guān)鍵的時(shí)期為開花灌漿期，其次為生長(zhǎng)期，成熟期和苗期的日需水量較小。

表2 蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作Table 2 The standard curve making of protease

蛋白酶活力測(cè)定:1 mL不同濃度的酵素(經(jīng)40 ℃恒溫水浴2 min)與1 mL 1%酪蛋白溶液(經(jīng)40 ℃恒溫水浴5 min)混合液于40 ℃水浴反應(yīng)10 min后,加入2 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸終止反應(yīng)。取出混合液搖勻,靜置10 min,用慢速定性濾紙過濾。取1 mL濾液,加入5 mL 0.4 mol/mL的碳酸鈉溶液與1 mL福林試劑溶液,搖勻。40 ℃水浴20 min后,用分光光度計(jì)于680 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度?？瞻讓?duì)照組的設(shè)置為在加入酪蛋白溶液前,加入0.4 mol/L的三氯乙酸2 mL使酶失活,其他步驟與上述相同。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白酶活力。公式如下:

式中:X-樣品的酶活力,U/mL;A-根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品稀釋液的酶活力,U/mL;4-反應(yīng)試劑的總體積,mL;n-稀釋倍數(shù);10-反應(yīng)時(shí)間為10 min,以1 min計(jì)。

1.2.3 青梅酵素體外抑菌活性測(cè)定

1.2.3.1 菌懸液的制備 在無菌條件下,分別將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上,在37 ℃培養(yǎng)18 h,活化兩次。取1環(huán)活化過的菌種接種于5 mL液體培養(yǎng)基中,于37 ℃培養(yǎng)18 h后,對(duì)菌懸液進(jìn)行平板計(jì)數(shù),使菌懸液的菌數(shù)量控制在1×108～2×108CFU/mL,備用[17]。

1.2.3.2 青梅酵素抑菌活性的測(cè)定 吸取100 μL待測(cè)菌懸液于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上,用涂布器將菌懸液涂開。用鑷子將無菌牛津杯輕放在培養(yǎng)基上,分別吸取0.2 mL經(jīng)過孔徑為0.22 μm濾膜處理的酵素于牛津杯中,以無菌水為空白對(duì)照。將培養(yǎng)基平放于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h。平行實(shí)驗(yàn)3次,測(cè)量抑菌圈直徑,取平均值[18]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖,SPSS 19.0進(jìn)行方差分析,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 青梅酵素的抗氧化性

2.1.1 總抗氧化性 利用抗氧化物質(zhì)可以將Mo(Ⅵ)還原為Mo(Ⅴ),并且在酸性的條件下形成綠色Mo(Ⅴ)的磷酸鹽,通過測(cè)定其吸光值來評(píng)價(jià)青梅酵素的抗氧化性。兩者呈正相關(guān)。吸光值越大,總抗氧化性越強(qiáng)。由圖1可知,當(dāng)VC濃度為120 μg/mL時(shí),溶液吸光值為0.512。當(dāng)青梅酵素濃度為0.3%時(shí),溶液吸光值為0.568。濃度為0.25%時(shí),青梅酵素總抗氧化性與100 μg/mL的VC抗氧化性相當(dāng)。青梅酵素濃度為0.25%時(shí),總抗氧化性增加迅速。青梅酵素總抗氧化性強(qiáng)可能是因?yàn)榍嗝饭麑?shí)中含有黃酮、VC、活性酶等抗氧化物質(zhì),青梅酵素中也相應(yīng)含有這些成分。

圖1 不同濃度青梅酵素的總抗氧化性Fig.1 The total antioxidant capacity of greengage ferment at different concentrations

圖2 不同濃度青梅酵素清除·OH的能力Fig.2 The ability to eliminate ·OH of greengage ferment at different concentrations

2.1.3 對(duì)DPPH·清除作用 目前,在測(cè)定果蔬制品抗氧化性時(shí),還會(huì)采用DPPH法[12]。DPPH·中間是氮,電子數(shù)為奇數(shù)。其溶在無水乙醇中的溶液是一種很深的顏色—紫色。測(cè)定其吸光值的波長(zhǎng)為517 nm。加入DPPH·清除劑與其單電子配對(duì),能夠降低吸光值。

由圖3可知,青梅酵素對(duì)DPPH·具有較好的清除作用,且隨著濃度的升高清除能力也增強(qiáng)。當(dāng)青梅酵素的濃度為8%的時(shí)候,清除率達(dá)96.5%。董銀卯[17]測(cè)定了10%濃度的火龍果酵素對(duì)DPPH·清除率為96%,二者相比,青梅酵素對(duì)DPPH·清除能力高于火龍果酵素。表明青梅酵素內(nèi)含有較強(qiáng)的對(duì)DPPH·清除物質(zhì),可能是由于與青梅酵素內(nèi)其他抗氧化物質(zhì)共同作用的結(jié)果。

圖3 不同濃度的青梅酵素清除DPPH·的能力Fig.3 The ability to eliminate DPPH· of greengage ferment at different concentrations

2.1.4 青梅酵素的還原力 測(cè)定青梅酵素還原力是評(píng)估其抗氧化性的一種方法。其還原力表現(xiàn)方法為測(cè)定吸光值的大小。

由圖4可得,VC和酵素的還原力都表現(xiàn)出一定的濃度依賴效應(yīng),而且隨著溶液濃度的升高,還原力也隨著增強(qiáng)。酵素濃度在30%時(shí),還原力有所降低。當(dāng)VC濃度為120 μg/mL時(shí),溶液吸光值為0.748。當(dāng)青梅酵素濃度在25%的時(shí)候,吸光值為0.954。同時(shí)可知,濃度為15%的青梅酵素還原力相當(dāng)于濃度為80 μg/mL的VC溶液。

圖4 不同濃度青梅酵素的還原力Fig.4 The reducing power of greengage ferment at different concentrations

2.2 青梅酵素的酶活力

2.2.1 青梅酵素的脂肪酶活力 以市售的橄欖油為底物,運(yùn)用NaOH滴定法經(jīng)計(jì)算得青梅酵素的脂肪酶活力是1.67 U/mL。由此可知,青梅酵素中存在脂肪酶活性,但活性較低。

2.2.2 青梅酵素的SOD活力 由圖5所知,隨著酵素濃度的增加,其抑制率和SOD活性也隨之相應(yīng)升高。在濃度為10%～20%時(shí),SOD活性增加很快。當(dāng)酵素的濃度為60%的時(shí)候,抑制率為100%。根據(jù)公式計(jì)算出,濃度60%時(shí)SOD的活性為57.89 U/mL。酵素濃度30%時(shí),SOD活性最高,達(dá)到75.64 U/mL。隨著濃度升高,酵素SOD活性有所降低,可能是因?yàn)榻退貪舛雀?部分SOD沒有參與反應(yīng)。與陳爽[15]、張夢(mèng)梅[20]對(duì)液體酵素和市售酵素的SOD活性測(cè)定分別為10.758和41.7 U/mL相比,青梅酵素的SOD酶活力更高。

圖5 青梅酵素的SOD活性Fig.5 The SOD enzyme activity of greengage ferment

2.2.3 青梅酵素的蛋白酶活力

2.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 利用分光光度計(jì)測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸在680 nm處的吸光值,繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖6。其中R2=0.9982,說明L-氨基酸與鎢藍(lán)和藍(lán)色鉬藍(lán)的混合物具有很好的線性關(guān)系?？梢岳迷摌?biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定酵素蛋白酶的活力。

圖6 酪氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 The standard curve of tyrosine

2.2.3.2 蛋白酶活力 由圖7可知,隨著酵素濃度的增加,其蛋白酶活力也隨之增強(qiáng)。當(dāng)酵素濃度為15%的時(shí)候,其蛋白酶活力為15.84 U/mL。使用福林法測(cè)定蛋白酶活力能夠降低酶活的損失,與陳爽[15]報(bào)道的12%濃度的水果酵素蛋白酶活力5.421 U/mL相比,蛋白酶活力要高。

圖7 青酶酵素的蛋白酶活性Fig.7 The protease activity of greengage ferment

2.3 青梅酵素的抑菌活性

由表3可知,青梅酵素對(duì)3種實(shí)驗(yàn)菌都有較強(qiáng)的抑制作用,均處于15～20 mm的高敏范圍,同時(shí)抑菌圈直徑差異顯著(p<0.05)。陳虹[5]等所測(cè)定的青梅原汁對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為17.6、21.8、22.2 mm。與之相比,青梅經(jīng)過發(fā)酵后對(duì)不同細(xì)菌的抑制作用發(fā)生了變化:青梅酵素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用有所增強(qiáng),對(duì)枯草芽孢桿菌以及大腸桿菌的抑制作用減弱。

表3 青梅酵素的抑菌圈直徑Table 3 Inhibitory zone diameter of greengage ferment

3 結(jié)論

青梅酵素的總抗氧化性較強(qiáng),青梅酵素體積濃度為0.25%時(shí),總抗氧化性與100 μg/mLVC溶液相當(dāng)。清除DPPH·的能力強(qiáng)于清除·OH的能力:體積濃度為8%時(shí),對(duì)DPPH·清除率達(dá)到96.5%;濃度為45%時(shí),對(duì)·OH的清除率為83.2%。體積濃度為25%時(shí),青梅酵素還原力最高,濃度為15%時(shí),青梅酵素還原力相當(dāng)于濃度為80 μg/mL的VC溶液。酵素體積濃度為30%時(shí),超氧化物歧化酶(SOD)活力最高,為75.64 U/mL;體積濃度為15%時(shí),蛋白酶活力為15.84 U/mL;脂肪酶活力較低,為1.67 U/mL。脂肪酶活力最低,表明青梅酵素消化脂肪的能力有限。青梅酵素對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌呈現(xiàn)較強(qiáng)的抑菌作用,抑菌圈直徑分別為:(19.9±0.56)、(17.2±0.26)、(19.0±0.3) mm。

因此,青梅酵素作為一種天然的食品,具有較好的功能活性,可以滿足人們對(duì)于天然功能性食品的需求,有進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行研究和開發(fā)實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。