進(jìn)境水產(chǎn)品中典型異尖線蟲恒溫實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)法的建立與應(yīng)用

柏建山，趙尚志，張森，鄧艷，黃燕瓊，何淑華，戴金，石磊

（1.廣州機(jī)場(chǎng)出入境檢驗(yàn)檢疫局國(guó)家水產(chǎn)品檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510470）

（2.暨南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)研究院，廣東廣州 510632）

異尖線蟲病是人感染異尖線蟲的第三期幼蟲引起的疾病，主要是由于食入生的或未熟的海魚，如壽司和生魚片等[1]。感染的異尖線蟲可以鉆入消化道，或移行到其它組織，從而引起人的急腹癥癥狀：如劇烈腹痛、惡心、嘔吐、腹瀉等[1～4]，還能導(dǎo)致人的過(guò)敏反應(yīng)[5～7]。引起異尖線蟲病的蟲種有6種[8]，即簡(jiǎn)單異尖線蟲、典型異尖線蟲、抹香鯨異尖線蟲、擬地新線蟲、對(duì)盲囊線蟲和宮脂線蟲。典型異尖是廣大熱帶及副熱帶地區(qū)的優(yōu)勢(shì)蟲種，嚴(yán)重威脅了人類的健康[3,4,9]，因此建立典型異尖線蟲快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法至關(guān)重要。

異尖線蟲的傳統(tǒng)鑒別方法是利用其形態(tài)學(xué)特征，依據(jù)其頭端、消化道、尾部結(jié)構(gòu)特征來(lái)判斷[10]。但各個(gè)蟲種間形態(tài)相似，在不同的生長(zhǎng)階段，其形態(tài)、結(jié)構(gòu)存在很大差異，單純的依靠形態(tài)學(xué)方法很難鑒定到種間差異。

近年來(lái)，利用分子生物學(xué)方法鑒定蟲種的方法得到發(fā)展，如PCR技術(shù)。但PCR技術(shù)耗時(shí)較長(zhǎng)、需要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，這導(dǎo)致PCR技術(shù)很難在基層推廣；免疫學(xué)方法也因特異性較差而受到限制。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)是一種體外的基因擴(kuò)增技術(shù)[11]。用4條特異性引物識(shí)別靶基因的6個(gè)區(qū)域，并加入兩條環(huán)引物加速反應(yīng)，利用一種具有鏈置換功能的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫條件(60～65 ℃)反應(yīng) 30～60 min，即可完成反應(yīng)。本研究將LAMP技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光技術(shù)相結(jié)合，利用實(shí)時(shí)熒光技術(shù)可以將LAMP反應(yīng)可視化，進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，根據(jù)擴(kuò)增曲線判斷結(jié)果。與普通LAMP技術(shù)相比，反應(yīng)時(shí)間更短，反應(yīng)的靈敏度和特異性更高，操作更為簡(jiǎn)便，成本更加低廉，適合在基層推廣應(yīng)用。

本研究根據(jù)典型異尖線蟲 ITS2區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物[12]，建立了典型異尖線蟲的恒溫實(shí)時(shí)熒光快速檢測(cè)方法，并且進(jìn)行了靈敏度、特異性和穩(wěn)定性驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 蟲體來(lái)源

典型異尖線蟲由廣州機(jī)場(chǎng)檢驗(yàn)檢疫局國(guó)家水產(chǎn)品檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在2015～2016年進(jìn)境海魚體中分離鑒定并保存。對(duì)比蟲體簡(jiǎn)單異尖線蟲(A. simplex)、短棘異尖線蟲(A.brevispiculata)、抹香鯨異尖線蟲(A.physeteris)、Anisakis nascettii、宮脂線蟲（Hysterothylacium Spp.）、對(duì)盲囊線蟲（Contracaccum Spp.）、顎口線蟲(Gnathostoma spp.)均由上述實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1.1.2 主要試劑

Bst DNA polymerase large fragment，美國(guó) New England Biolabs公司；甜菜堿(Betaine)、MgCl2，美國(guó)Sigma公司；SYBR Green Ⅰ熒光染料，Life Technologies公司；引物，上海英濰捷基貿(mào)易有限公司；DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、18-T載體克隆試劑盒、DH5α菌株、質(zhì)粒提取試劑盒、Tap酶、Mg2+、dNTPs、PCR10×Buffer反應(yīng)液均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蟲體基因組

DNA提取，將蟲體從保存液中取出，置于1.5 mL離心管中，用蒸餾水反復(fù)浸泡清洗3次，每隔2 h換水1次，使用Takara公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒，按照說(shuō)明書步驟提取異尖線蟲基因組DNA，微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)基因組DNA的濃度，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

GenBank中獲得典型異尖線蟲 ITS2(AY826724)序列，根據(jù)ITS2的保守區(qū)，利用在線設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer version4(http://primerexplorer.jp/e)進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)3套引物，將設(shè)計(jì)好的引物序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列特異性比對(duì)。Oligo 7.0對(duì)引物之間的二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、錯(cuò)配等情況進(jìn)行分析，引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。根據(jù)引物篩選試驗(yàn)結(jié)果，選取最優(yōu)引物，最終使用的引物為第二套引物（見表1）。

表1 恒溫實(shí)時(shí)熒光法引物序列Table 1 Sequence of primers for the real-time LAMP

1.2.3 質(zhì)粒構(gòu)建

用LAMP引物的外引物F3、B3對(duì)典型異尖線蟲基因組 DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，使用 Takara公司的Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒，按照說(shuō)明書步驟進(jìn)行DNA片段的回收，使用Takara公司的pMDTM 18-T Vector Cloning Kit試劑盒，按照說(shuō)明書步驟進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建，使用 Takara公司的 Plasmid Purification Kit Ver.4.0試劑盒，按照說(shuō)明書步驟進(jìn)行質(zhì)粒的提取。用NanoDrop2000微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)粒DNA的濃度，將質(zhì)粒置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 恒溫實(shí)時(shí)熒光法反應(yīng)體系的建立

本研究采用 25 μL反應(yīng)體系，8 mM dNTP、10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液、120 mM MgSO4水溶液、F3 0.2 μM、B3 0.2 μM、FIP 1.6 μM、BIP 1.6 μM、LF 0.8 μM、LB 0.8 μM、DNA聚合酶8 U、10×SYBR Green I 0.5 μL、待檢樣品2 μL，用超純水補(bǔ)齊到25 μL，最后在體系表面加密封油防止污染，將配制好的反應(yīng)管混勻后離心，以典型異尖線蟲DNA為陽(yáng)性對(duì)照，超純水為陰性對(duì)照，于LAMP恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)儀（廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司）中63 ℃反應(yīng)45 min。

結(jié)果判讀方法：若有“S”型擴(kuò)增曲線，則判斷為陽(yáng)性，若無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線，則判斷為陰性。

1.2.5 特異性試驗(yàn)

用建立的恒溫實(shí)時(shí)熒光法對(duì)其它寄生蟲簡(jiǎn)單異尖線蟲（A. simplex）、短棘異尖線蟲（A. brevispiculata）、抹香鯨異尖線蟲（A. physeteris）、anisakis nascettii、宮脂線蟲（Hysterothylacium Spp.）、對(duì)盲囊線蟲（Contracaccum Spp.）、顎口線蟲（Ggnathostoma spp.）的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.6 靈敏度試驗(yàn)

將含目的基因片段的質(zhì)粒DNA以10倍的梯度稀釋到 1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、100 ag/μL、10 ag/μL，取 10 pg/μL～10 ag/μL濃度的模板進(jìn)行恒溫實(shí)時(shí)熒光法擴(kuò)增。

1.2.7 與PCR方法比較

用外引物 F3、B3作為 PCR 引物對(duì) 10 pg/μL～1 fg/μL質(zhì)粒模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系為25 μL：2.5 μL 10×PCR buffer，2 mM Mg2+，0.8 mM dNTPs，0.4 μM F3 引物，0.4 μM B3引物，1.25 U Taq酶(Takara)，2 μL DNA模板，用超純水補(bǔ)齊至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s、60 ℃退火延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳20 min。

1.2.8 實(shí)際樣品的檢測(cè)

對(duì)廣州機(jī)場(chǎng)檢驗(yàn)檢疫局國(guó)家水產(chǎn)品檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在2015年至2016年，5批次來(lái)自熱帶地區(qū)海魚體內(nèi)檢出的異尖線蟲進(jìn)行檢測(cè)，共選取41條蟲體進(jìn)行恒溫實(shí)時(shí)熒光法檢測(cè)，并與 PCR檢測(cè)方法進(jìn)行比較。PCR檢測(cè)方法依據(jù)中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) SC/T 7210-2011，使用上游引物 390（5’-ATCCGTGTTTCAAGACGGG-3’）和下游引物391（5’-AGCGGAGGAAAAGAAACTAA-3’）對(duì)蟲體DNA進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系參照1.1.5，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。反應(yīng)產(chǎn)物大小為800 bp左右，送測(cè)序公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行序列比對(duì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 恒溫實(shí)時(shí)熒光法反應(yīng)條件的確定

圖1 恒溫實(shí)時(shí)熒光法引物反應(yīng)效率的檢測(cè)Fig.1 Detection of the reaction efficiency of the real-time LAMP primers

用3套特異性引物對(duì)典型異尖線蟲DNA進(jìn)行恒溫實(shí)時(shí)熒光法擴(kuò)增，篩選出最優(yōu)的特異性引物。結(jié)果顯示，3套引物均能擴(kuò)增，而第二套引物擴(kuò)增曲線最標(biāo)準(zhǔn)，出峰時(shí)間最短（見圖1），所以選取第二套引物作為本研究的特異性引物。

2.2 特異性試驗(yàn)

圖2 典型異尖線蟲恒溫實(shí)時(shí)熒光法特異性試驗(yàn)Fig.2 Assessment of specificity of the real-time LAMP assay for A.typica

特異性試驗(yàn)表明，對(duì)于短棘異尖線蟲（A.brevispiculata）、抹香鯨異尖線蟲（A. physeteris）、典型異尖線蟲（A. typica）、anisakis nascettii、宮脂線蟲（Hysterothylacium spp.）、對(duì)盲囊線蟲（Contracaccumspp.）、顎口線蟲（Ggnathostoma spp.）的DNA模板，未產(chǎn)生“S”型擴(kuò)增曲線，說(shuō)明沒(méi)有目的片段擴(kuò)增，對(duì)于典型異尖線蟲DNA模板，產(chǎn)生“S”型擴(kuò)增曲線，說(shuō)明目的片段能夠擴(kuò)增（見圖2），表明建立的典型異尖線蟲的恒溫實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法具有嚴(yán)格的特異性。

2.3 靈敏度試驗(yàn)

圖3 典型異尖線蟲恒溫實(shí)時(shí)熒光法的靈敏度試驗(yàn)Fig.3 Assessment of sensitivity of the real-time LAMP for A.typica

圖4 典型異尖線蟲恒溫實(shí)時(shí)熒光法與PCR方法的比較Fig.4 Comprision of the real-time LAMP for A.typica and theconventional PCR

含目的基因片段的質(zhì)粒濃度為29 ng/μL，將其稀釋到 1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、100 ag/μL、10 ag/μL，選取 10 pg/μL～10 ag/μL質(zhì)粒模板進(jìn)行恒溫實(shí)時(shí)熒光法擴(kuò)增，其檢測(cè)限為1 fg/μL（見圖3）。用PCR方法對(duì)相同濃度的質(zhì)粒模板進(jìn)行擴(kuò)增，其檢測(cè)限為100 fg/μL（見圖4），恒溫實(shí)時(shí)熒光法的靈敏度比PCR方法高出兩個(gè)數(shù)量級(jí)。表明建立的典型異尖線蟲恒溫實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法具有很高的靈敏度。

2.4 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

圖5 典型異尖線蟲恒溫實(shí)時(shí)熒光法的穩(wěn)定性試驗(yàn)Fig.5 Assessment of stability of the real-time LAMP for A.typica

用恒溫實(shí)時(shí)熒光法對(duì)最低檢測(cè)限1 fg/μL的質(zhì)粒模板進(jìn)行15次重復(fù)試驗(yàn)，驗(yàn)證本研究的穩(wěn)定性和重復(fù)性。對(duì)1 fg/μL質(zhì)粒模板的15次平行試驗(yàn)，均產(chǎn)生“S”型擴(kuò)增曲線，說(shuō)明全部擴(kuò)增，且出峰時(shí)間相差不大，擴(kuò)增曲線標(biāo)準(zhǔn)，重復(fù)性良好，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增，假陽(yáng)性率為0（見圖5）。表明建立的典型異尖線蟲的恒溫實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

用恒溫實(shí)時(shí)熒光法對(duì)5批次來(lái)自熱帶地區(qū)的進(jìn)境實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與PCR檢測(cè)方法進(jìn)行比較。恒溫實(shí)時(shí)熒光法檢測(cè)結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致，假陽(yáng)性率為0（見表2）。說(shuō)明本研究建立的LAMP檢測(cè)方法適用于典型異尖線蟲實(shí)際樣本的檢測(cè)。

表2 實(shí)際樣品中恒溫實(shí)時(shí)熒光法和PCR方法檢測(cè)典型異尖線蟲的結(jié)果Table 2 Detection results for detrction A.typica by real-time LAMP method and PCR method in samples

3 結(jié)論

3.1 自1960年van Thiel在荷蘭發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了異尖線蟲病例后，國(guó)際上感染并報(bào)道的異尖線蟲病例越來(lái)越多。至今，全世界已有超過(guò)3萬(wàn)異尖線蟲病例，所以異尖線蟲日益受到各界的重視，我國(guó)已將異尖線蟲列為二類禁止入境的寄生蟲。我國(guó)在2013年報(bào)道了首例異尖線蟲病病例[13]，隨著人口流動(dòng)、文化傳播以及國(guó)際貿(mào)易的全球化，特別是人們生食魚肉變得越來(lái)越普遍，異尖線蟲病的發(fā)生率也在不斷增加，由異尖線蟲或其過(guò)敏物質(zhì)引起的過(guò)敏反應(yīng)也在不斷增加[14]。在所有的致病種中，典型異尖線蟲廣泛存在于熱帶及副熱帶地區(qū)，是很多海域的優(yōu)勢(shì)蟲種[3,4,9,15,16]，廣州機(jī)場(chǎng)出入境檢驗(yàn)檢疫局國(guó)家水產(chǎn)品檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室對(duì)來(lái)自孟加拉、越南和澳大利亞等國(guó)家的海魚進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了大量的典型異尖線蟲，并且肌肉中的感染率很高，嚴(yán)重威脅了人類的健康。

3.2 為了能夠更好的檢測(cè)典型異尖線蟲，有效控制其傳播和感染，快速、靈敏和準(zhǔn)確的檢測(cè)方法是必不可少的。LAMP方法已經(jīng)應(yīng)用于檢測(cè)食源性病原的多個(gè)領(lǐng)域，如：細(xì)菌、病毒、真菌、原蟲[17,18]，但在蠕蟲檢測(cè)上的應(yīng)用還很少，影響了蠕蟲病病原檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。以往，LAMP檢測(cè)方法的結(jié)果判定有凝膠電泳法、顯色法、濁度法。凝膠電泳法需要開蓋才能完成，可能產(chǎn)生氣溶膠污染，而造成假陽(yáng)性；顯色法是最經(jīng)濟(jì)的方法，不需要在反應(yīng)過(guò)程中收集信號(hào)，只需恒溫水浴鍋即可完成反應(yīng)，但顯色法需要反應(yīng)結(jié)束后開蓋加入顯色液，也容易造成擴(kuò)增產(chǎn)物的氣溶膠污染；濁度法包括焦磷酸鎂沉淀觀察法和實(shí)時(shí)濁度法，不需要添加額外的試劑，不需要開蓋，但焦磷酸鎂沉淀觀察法存在人為判斷的主觀性，實(shí)時(shí)濁度法也因渾濁顆粒不均一和反應(yīng)液存在不透明顆粒等因素導(dǎo)致較低的靈敏度。為了克服上述方法的不足，恒溫實(shí)時(shí)熒光法不斷被發(fā)開并應(yīng)用于實(shí)際的樣品檢測(cè)中，它是一種新型的可視化方法，將LAMP技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)有機(jī)的結(jié)合，可以對(duì)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行及時(shí)判讀，在保證高敏感性的同時(shí)，使檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)化、形象化，不同于終點(diǎn)判讀方法，可以在反應(yīng)過(guò)程中對(duì)出峰時(shí)間、擴(kuò)增曲線以及擴(kuò)增效率進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，使反應(yīng)時(shí)間更短，在一定程度上避免了假陽(yáng)性的存在。

3.3 本研究根據(jù)典型異尖線蟲的ITS2特異性基因，建立了典型異尖線蟲的恒溫實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)法，該方法具有靈敏度高、特異性好、方便和快速等優(yōu)點(diǎn)，靈敏度可達(dá)1 fg/μL，反應(yīng)時(shí)間短，45 min內(nèi)便可完成反應(yīng)，而傳統(tǒng)的PCR方法至少需要2～3 h。在澳大利亞等國(guó)家進(jìn)境水產(chǎn)品中應(yīng)用該方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該檢測(cè)方法具有廣泛的實(shí)用性和良好的應(yīng)用前景，特別適合于在基層和各進(jìn)行推廣和應(yīng)用。