六類魚制品中生物胺的HPLC法測定

曾萍，黃文玲，張友勝，張業(yè)輝，劉學(xué)銘，程鏡蓉，汪婧瑜

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部功能食品重點實驗室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州 510610）（2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

魚制品是指以魚為原料，添加或不添加輔料，經(jīng)相應(yīng)加工工藝生產(chǎn)的魚加工產(chǎn)品的總稱，包括即食和非即食產(chǎn)品[1]。按產(chǎn)品形態(tài)可分固態(tài)（魚片、魚干、魚丸和魚香腸等）、液態(tài)（魚露和魚油）和醬態(tài)（魚子醬和魚膏）三類；按加工方式可分為干燥制品（魚干）、油炸制品（烤魚片和油炸魚罐頭）、烘烤制品（烤魚片）、發(fā)酵制品（魚露）、混揉制品（魚豆腐、魚丸和魚香腸）以及萃取制品（魚油）等六大類型。由于魚制品具備生物胺形成所需要的豐富的前體物質(zhì)（氨基酸），所以魚制品中的生物胺種類和含量可以作為衡量此類食品新鮮度和質(zhì)量高低的一個重要指標[2,3]。若某原料產(chǎn)品中某種生物胺或者生物胺總量過高則說明其可能受到具有氨基酸脫羧酶活性的微生物如鏈球菌屬、桿菌屬、梭菌屬、埃希氏菌屬、變形菌屬、克雷伯氏菌屬、假單胞菌屬和沙丁氏菌屬等的污染[4～6]，因此生物胺是魚制品質(zhì)量高低的一個重要衡量指標。

生物胺是一類具有生物活性的低分子含氮有機化合物的總稱[7,8]。適量的生物胺對人體的各種生理機能具有調(diào)節(jié)作用，只有在體內(nèi)積聚達到高水平或攝入量很高時才具有毒性[9～11]。目前應(yīng)用于食品中生物胺含量測定的方法主要有高效液相色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、毛細管電泳法和基質(zhì)分散固相萃取-親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[12～14]，最常見的方法仍為高效液相色譜法。

由于不同魚制品中的原料、加工方式以及加工環(huán)境和貯藏條件的不盡相同，其生物胺種類和含量可能有明顯區(qū)別，但目前鮮有學(xué)者對此進行研究。盡管食品安全國家標準《動物性水產(chǎn)制品（GB 10136-2015）》規(guī)定了鹽漬魚（高組胺魚類）中組胺含量要求≤40 mg/100 g，其它海水魚類要求≤20 mg/100 g，且規(guī)定了生物胺的檢測按照《GB/T 5009.208-2008食品中生物胺含量的測定》方法進行，但該方法針對的是所有食品中生物胺的檢測，就魚制品中生物胺檢測而言，方法顯得太粗糙，尤其是在樣品前處理和生物胺衍生步驟中的誤差較大。為此，本文在參考《GB/T 5009.208-2008食品中生物胺含量的測定》的基礎(chǔ)上，建立了魚制品中8種生物胺同時檢測的HPLC的檢測方法，同時對6類魚制品中的8種生物胺進行了測定，以便為魚制品中生物胺的檢測、產(chǎn)品監(jiān)控以及今后相關(guān)標準的修（制）訂提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

試劑：氫氧化鈉、碳酸氫鈉、鹽酸、三氯乙酸、正丁醇、氯化鈉、三氯甲烷、丙酮均為分析純；正己烷、甲醇為色譜純；電阻率為18.2 MΩ.cm的超純水。

標準品：β-苯乙胺（β-phenyl ethylamine，β-PHE，純度＞98%）；腐胺（putrescine，PUT，純度＞98%）；尸胺（cadaverine，CAD，純度＞98%）；組胺（histamine，HIS，純度＞97%）；酪胺（tyramine，TYR，純度＞98%）；亞精胺（spermidine，SPD，純度＞97%）；精胺（spermine，SPM，純度＞97%）；色胺（tryptamine，Try，純度＞99%）；丹磺酰氯（dansylchoride，DnS-Cl，純度＞95%）；1,7-二氨基庚烷（1,7-diaminoheptane，1,7-DH，純度＞98%）（內(nèi)標）。以上標準品均購于sigma公司。

樣品：從市場上購買了6類魚制品共13個樣品，包括2個魚干制品（鯇魚干和鱈魚絲各1個）、油炸制品3個（鯪魚罐頭、辣味小雜魚仔和金槍魚罐頭各1個）、燒烤制品2個（馬面鲀烤魚片和鯇魚烤魚片各1個），發(fā)酵制品2個（魚露2種）、混揉制品3個（魚豆腐、魚丸和魚香腸各1種）以及萃取制品1個（魚油）等類型。

1.2 儀器與設(shè)備

TG16-WS型臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；PRACTOM2102-1CN型電子天平，廣州市深華生物技術(shù)有限公司；KB3型試管振蕩儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Milli-Q Integral 5型超純水系統(tǒng)，Merk Millipore/德國；KDB-12多功能氮吹儀，青島科迪博電子科技有限公司；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LC1200高效液相色譜，美國安捷倫公司；SB-C18柱（4.6×250 mm，5 μm），化學(xué)工作站。

1.3 方法

參考GB/T 5009.208-2008食品中生物胺含量的測定。實驗原理為以 1,7-二氨基庚烷為內(nèi)標，以三氯乙酸為提取溶劑，以丹磺酰氯為衍生劑，外標法定量測定。

1.3.1 標準溶液及試劑的制備

標準溶液：準確稱量上述標準品，用超純水配制的0.1 mol/L HCl作為溶劑，配制成1 g/L的單標，4 ℃冰箱保存。

飽和NaHCO3溶液：用超純水溶解碳酸氫鈉，使溶液達到飽和，取上清液。

氫氧化鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液體系（pH 9.5）：把1 mol/L NaOH加入飽和NaHCO3溶液中，調(diào)節(jié)pH值至9.5。

丹磺酰氯衍生化試劑：準確稱取丹磺酰氯，用丙酮作為溶劑，配成濃度為10 mg/mL的溶液，-20 ℃冰箱避光保存。

1.3.2 樣品處理

1.3.2.1 樣品前處理

經(jīng)多種樣品前處理方式比較，最終確定樣品前處理方法如下：對固體樣品而言，分別取2～5個獨立包裝產(chǎn)品（樣品重量不少于200 g）中的所有固體原料（包括制品中的調(diào)味原料，不包括其中的溶液），用絞碎機重復(fù)絞碎2次，混勻；對液體和膏狀產(chǎn)品（包括魚油）而言，直接將2～5個獨立包裝產(chǎn)品（樣品重量不少于200 mL）混合一起。

1.3.2.2 生物胺提取

稱取10.0 g或10.0 mL上述前處理后的樣品，加入20.0 mL 5%三氯乙酸和2.0 mL內(nèi)標使用液，混勻、震蕩提取60 min，離心（3600 r/min，10 min）。取上清液于50 mL容量瓶中，用5%三氯乙酸重復(fù)提取2次，合并上清，用 5%三氯乙酸定容，濾紙過濾，待凈化去脂肪。

1.3.2.3 樣品凈化去脂肪

取10 mL上述樣品提取液，加入10 mL正己烷（1:1），旋渦震蕩5 min，去除上層有機相，重復(fù)2次。在去除有機相的溶液中加入適量 NaCl使溶液達到飽和。取5 mL飽和液，用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH至12.0。加入5.0 mL正丁醇-三氯甲烷（1+1）混合液，旋渦震蕩5 min，離心（3600 r/min，10 min）。吸取下層有機相，重復(fù)萃取2次，合并萃取液。取3 mL萃取液和0.2 mL、1 mol/L HCl溶液于40 ℃水浴下氮氣吹干，重新加入1.0 mL、0.1 mol/L HCl使殘留物溶解，待衍生。

1.3.2.4 生物胺的衍生[15]

取1 mL上述待衍生樣品溶液，加入0.5 mL丹磺酰氯衍生劑和1 mL氫氧化鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液（pH 9.5），旋渦混勻1 min，60 ℃水浴鍋中避光反應(yīng)30 min，中間震蕩2次。

取出冷卻至室溫后，加入3 mL乙酸乙酯，旋渦混勻1 min，離心（4000 r/min，5 min），吸取上層有機相，重復(fù)萃取2次，合并萃取液，40 ℃水浴下氮氣吹干，加入1 mL甲醇使殘留物溶解，0.22 μm有機濾膜針頭濾器過濾并裝瓶，待上機分析。

1.3.3 標準曲線的回歸方程及方法的檢出限

1.3.3.1 標準曲線的回歸方程

各吸取1 mL單標于容量瓶中，用0.1 mol/L HCl作為溶劑，配成100 mg/L的標準品混合使用液，將該溶液稀釋成濃度為0.5、1、2、5、10、20 mg/L的溶液，進行生物胺的衍生，衍生后進行HPLC測定，每種濃度平行測定3次，并繪制出標準曲線圖，得到相關(guān)的標準方程、相關(guān)系數(shù)，以信噪比（S/N）＞3作為判斷標準，獲得最低檢出限。

1.3.3.2 重復(fù)性測定

對8種生物胺標準品混合使用液進行5次重復(fù)性測定，計算其RSD(%)值。

1.3.3.3 加標回收試驗

向樣品中加入濃度為4或5 mg/L的標準品混合使用液，按上述方法重復(fù)3次，進行回收率測定，扣除樣品中空白試驗生物胺的含量，求得其添加標準品的回收率。

1.3.4 色譜條件

LC1200高效液相色譜：檢測器為紫外檢測器；波長為254 nm；色譜柱為SB-C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動相A為甲醇，B為超純水；柱溫為30 ℃；流速為1 mL/min；進樣量為20 μL；采用梯度洗脫程序，見表1。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution program

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析(ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準品色譜圖

圖1 8種生物胺標準品HPLC色譜圖（10 mg/L）Fig.1 HPLC Chromatography of eight biogenic amines standards

實驗用上述8種生物胺標準品配制成混標進行實驗，色譜圖（圖 1）顯示各標準品之間分離較好，鮮有拖尾現(xiàn)象發(fā)生。

2.2 標準曲線的測定及檢出限

HPLC法測定生物胺的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2，其中8種生物胺都呈線性關(guān)系（≥0.9504），所得的檢出限結(jié)果表明這8種生物胺的靈敏度都比較高，該方法能夠檢出含量較低的生物胺。

2.3 重復(fù)性測定

對8種生物胺混標進行重復(fù)性測定，其結(jié)果見表3，結(jié)果顯示，相對標準偏差 RSD（%）≤3.37，表明重復(fù)性較好，同時也說明儀器檢測具有較好的精密度，且檢測方法具有較好的適用性。

表2 HPLC法測定生物胺的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 2 Determination of regress equations, correlation coefficient and detection limits of biogenic amines by HPLC

表3 生物胺的重復(fù)性實驗Table 3 Reproducibility of biogenic amines (mg/L)

2.4 回收率測定

回收率測定實驗結(jié)果見表 4，結(jié)果顯示，回收率在88.46%～103.25%之間，說明回收率較高，測定結(jié)果較為準確。

表4 加標回收率實驗Table 4 Experiment of addition standard recovery (n=3)

2.5 各種制品中生物胺含量的測定

采用上述HPLC方法對6種不同類型的魚制品中的8種生物按進行了測定（表5）。由表5可以看出，不同類型的魚制品中的生物胺種類和含量呈現(xiàn)明顯差別。

從生物胺類型來看，萃取產(chǎn)品魚油中沒有檢測出生物胺，發(fā)酵產(chǎn)品中8種生物胺都存在，其它所有樣品中均檢測到尸胺、組胺、精胺、亞精胺4種生物胺，除油炸魚制品中的金槍魚罐頭和辣味小雜魚仔樣品外，其余魚制品均檢測到腐胺。其原因可能在于生物胺為極性類化合物，魚油產(chǎn)品本身為非極性脂類化合物，在生產(chǎn)過程中生物胺難以進入產(chǎn)品之中，另外在產(chǎn)品貯藏過程中由于沒有氨基酸類前體物質(zhì)，所以無法生成生物胺。

從生物胺的總量來看，除萃取產(chǎn)品魚油外，含量最高的為發(fā)酵制品（73.42～70.59 mg/kg）和混揉制品（55.48～49.88 mg/kg），其次為油炸制品（17.72～14.32 mg/kg），最少的為魚干（5.28～5.17 mg/kg）和烘烤制品（4.75～4.69 mg/kg）。其原因可能在于魚制品發(fā)酵或貯藏過程中，容易受到微生物污染，微生物中普通存在氨基酸脫羧酶活性，可以使氨基酸轉(zhuǎn)化為生物胺從而使發(fā)酵制品和混揉中的生物胺總量最高，這與前人研究結(jié)果相符[16,17]。

在已檢出生物胺的5種魚制品中，除魚干制品和燒烤制品外，所有樣品中的尸胺含量遠遠高于其它生物胺，這可能與產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝有關(guān)系。尸胺又稱戊二胺，是賴氨酸在脫羧酶作用下發(fā)生脫羧反應(yīng)生成，它與腐胺都是生物體腐敗分解產(chǎn)物[18]。一般生產(chǎn)魚干制品和燒烤制品時，從原料處理到成品生產(chǎn)，間隔時間短，微生物污染輕，而其它3類制品在生產(chǎn)過程中都存在較長的中間時間，有可能受到微生物污染；另外也說明，微生物污染產(chǎn)生的主要生物胺為尸胺，尸胺應(yīng)該是魚制品生產(chǎn)和監(jiān)控的重點。

另外，從魚制品的生產(chǎn)原料來看，如魚干中的鯇魚、鱈魚，油炸制品中的鯪魚、金槍魚和小雜魚，烘烤制品中的馬面鲀和鯇魚，的原料對制品中生物胺的影響并不明顯。

表5 各種魚制品中生物胺的含量Table 5 Content of biogenic amines in all kinds of fish products (mg/kg, n=3)

3 結(jié)論

3.1 本文對6種不同類型魚制品中的8種生物胺進行了測定，發(fā)現(xiàn)除萃取制品魚油外，其余5類制品中主要存在尸胺、組胺、精胺和亞精胺四種生物胺。相關(guān)研究證明[18～20]，組胺是生物胺中毒性最大的生物胺，其水平偏高會導(dǎo)致頭痛、高血壓以及消化障礙，組胺含量過高是引起食品中毒的主要原因之一，毒性次之的酪胺則易引起偏頭痛和高血壓等不適反應(yīng)。生物胺中的尸胺和腐胺雖然毒性較小，但是能抑制組胺和酪胺代謝酶的活性，從而增加組胺和酪胺的毒性。此外，腐胺、尸胺、精胺和亞精胺可以與食物中的亞硝酸鹽反應(yīng)產(chǎn)生致癌物質(zhì)亞硝基胺。生物胺引起人體中毒的水平因人而異，很難建立統(tǒng)一的衡量標準。因此，在描述某類食品中生物胺存在狀況或者對某類食品中生物胺進行風(fēng)險評估時最好將生物胺總量和主要單體生物胺放在一起進行綜合研究才能得出正確的結(jié)論。

3.2 目前我國強制執(zhí)行的食品安全國家標準《動物性水產(chǎn)制品（GB 10136-2015）》只規(guī)定了鮐魚等高組胺鹽漬魚類中組胺含量要求≤40 mg/100 g，其它海水魚類制品要求≤20 mg/100 g，其中對生物胺的總量沒有規(guī)定，也沒有對其它魚制品中的組胺含量進行規(guī)定。從本文檢測結(jié)果來看，生物胺總量和組胺含量最高的魚制品均為發(fā)酵制品，分別為 73.42 mg/kg和 7.76mg/kg，遠遠低于我國國家標準，因此所有制品均符合國家要求。不過，從本文檢測結(jié)果來看，對魚制品而言，單體生物胺中變化最大、差異最明顯不是組胺而是尸胺，其結(jié)果與陳玉峰等人測定三牙魚、白立魚、馬友魚、大黃魚和海鱸銀鯧、馬鮫等7種魚干中生物胺的結(jié)果一致[21]；因此，我們認為，對于監(jiān)控、評判魚干制品的質(zhì)量最好的單體生物胺應(yīng)該是尸胺而不是組胺，這可能與國內(nèi)外將原料魚分為高組胺魚、低組胺魚類有關(guān)，也可能與組胺的毒性研究深入有關(guān)。

3.3 魚制品中生物胺種類和數(shù)量很大程度受原料、加工過程、保藏條件等影響，建立一種能同時測定魚制品中組胺和其它與之作用的生物胺含量的方法有重大意義，而本文建立的HPLC法，可同時測定各種魚制品中的生物胺，通過線性、準確度、精密度和魚制品樣品的測定，充分驗證了該方法的可行性，為快速準確地判定魚制品的安全性提供了一定的技術(shù)保證。