鱸魚（Lateolabrax japonicus）蛋白抗氧化肽的酶解制備及結(jié)構(gòu)鑒定

趙翊君，鄭淋，蔡勇建，趙強(qiáng)忠

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

蛋白質(zhì)經(jīng)不同蛋白酶酶解后，可以得到生物活性肽。近年來許多研究表明，活性肽具有易吸收，高活性，低分子量等特點[1]，可廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和藥品中。制備動物蛋白肽通常采用酶法水解，酶解法制備的產(chǎn)品因為生產(chǎn)條件溫和，水解條件容易控制，水解產(chǎn)物的安全性也較高[2]。在酶法制備中，常用的商業(yè)蛋白酶有中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、Alcalase 2.4 L和復(fù)合蛋白酶等。

廣東淡水魚資源豐富，鱸魚的產(chǎn)量尤其突出。鱸魚（Lateolabrax japonicus），為真鱸科類動物。鱸魚價格低廉，營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)，脂肪含量低，氨基酸組成平衡合理，開發(fā)潛力巨大[3]。目前對鱸魚的研究主要集中在保鮮、繁殖和營養(yǎng)等方面[4～6]，而對于酶解鱸魚蛋白制備抗氧化肽的研究鮮見報道。因此，利用現(xiàn)代食品生物技術(shù)-控制酶解技術(shù)對鱸魚進(jìn)行深度開發(fā)，制備出具有抗氧化的富肽酶解物并開發(fā)系列保健食品，可提高現(xiàn)有資源的利用率，增加漁農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益，為鱸魚的深度加工提供一條新的途徑。

近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)相較于傳統(tǒng)方法，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法鑒定多肽的結(jié)構(gòu)具有諸多優(yōu)勢。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法既發(fā)揮了現(xiàn)代色譜對復(fù)雜樣品的高分離能力，又應(yīng)用了質(zhì)譜具有的高選擇性、高靈敏度以及能夠準(zhǔn)確提供化合物的分子量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點，適合鑒定多肽的結(jié)構(gòu)，因此色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法已經(jīng)成為鑒定蛋白質(zhì)和多肽的首選方法[7]。

本實驗以鱸魚肉蛋白為原料，以體外抗氧化活性（ABTS和ORAC）、水解度（DH）和蛋白回收率為指標(biāo)，篩選出最佳水解酶，得到鱸魚抗氧化肽，并通過 UPLC-MS/MS對鱸魚抗氧化肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，然后進(jìn)一步合成肽段驗證其抗氧化活性，旨在探索鱸魚深加工途徑，為鱸魚抗氧化肽的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活體鱸魚于夏季購于廣州南沙農(nóng)貿(mào)市場。

風(fēng)味蛋白酶（500 LAPU/g）、復(fù)合蛋白酶（1.5 AU/g）、中性蛋白酶（1.5 AU/g）、及Alcalase 2.4 L（2.4 AU/g），丹麥 Novozymes公司；木瓜蛋白酶（200000 u/g），南寧龐博生物工程有限公司；鄰苯二甲醛（OPA）、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）、偶氮二異丁脒鹽酸鹽（AAPH）、熒光素鈉、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），美國 Sigma公司；乙腈及甲醇等均為色譜純級，美國 Sigma公司；合成的肽購于南京杰肽生物科技有限公司，包括 GGGAGMLLK、TDAETKTF、AGDSDGDGKIG、FIEEDELK、EYGTVVVFQ、ALTDAETKTF、HRDRLCVVQ、FIEEDELKLF及 AVIDQDKSGFIEEDELK，純度均高于95%。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-754N紫外可見光分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；全波長掃描多功能讀數(shù)儀，美國Thermo Fisher Scientific科技公司；ST 16R高速冷凍離心機(jī)，美國 Thermo Fisher Scientific科技公司；ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀，美國Waters公司；Impact Ⅱ高分辨四級桿飛行時間質(zhì)譜儀（UHR-QqTOF Mass），德國Bruker公司；數(shù)顯pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Alpha 2-4 LDplus真空冷凍干燥機(jī)，德國Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen公司。

1.3 方法

1.3.1 鱸魚的酶解

將新鮮鱸魚經(jīng)去頭去尾去骨去皮得到鱸魚魚肉，然后通過絞肉機(jī)制成魚糜，取20 g魚肉肉糜，加入40 mL純凈水，攪拌均勻，分別加入不同蛋白酶，加酶量為 0.5%（以鱸魚魚糜計），酶解溫度為 50 ℃，在各酶的最適水解pH值下（木瓜蛋白酶：pH 7.0，復(fù)合蛋白酶：pH 7.0，中性蛋白酶：pH 7.0，風(fēng)味蛋白酶：pH 7.0，Alcalase 2.4 L：pH 8.0）進(jìn)行酶解，酶解時間6 h，酶解液經(jīng)沸水浴滅酶15 min，4 ℃，8000 g下離心10 min，取上清液，冷凍干燥，即為鱸魚蛋白酶解產(chǎn)物。

1.3.2 水解度（DH）的測定

水解度（degree of hydrolysis，簡稱DH）是指已斷裂肽鍵所占百分比，使用鄰苯二甲醛（OPA）[8]方法定量分析。3 mL OPA試劑與400 μL樣品混勻作為樣品組，水作對照組，0.97 mM絲氨酸作標(biāo)準(zhǔn)組，反應(yīng)2 min，測定其在340 nm處的吸光度值。

1.3.3 蛋白回收率的測定

總氮的測定采用凱氏定氮法[9]。分別測定原料蛋白質(zhì)含量和酶解液的蛋白質(zhì)含量，按以下公式計算蛋白質(zhì)回收率：

1.3.4 抗氧化活性的測定

1.3.4.1 ORAC法(Oxygen radical absorbance capacity)

ORAC的測定參照文獻(xiàn)[10]的方法。該反應(yīng)在 75 mM磷酸鈉緩沖液（pH 7.4）體系中進(jìn)行。取20 μL 0.1 mg/mL樣品加入96孔熒光板為空中，再加入120 μL 70 mM熒光素溶液（最終濃度）。將混合物37 ℃預(yù)培養(yǎng)15 min后，迅速用多道移液器加入60 μL 12 mM AAPH溶液。讀數(shù)前搖晃30 s，每1 min記錄一次熒光值，記錄100 min。激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為485 nm和520 nm?？瞻捉M使用磷酸緩沖液代替抗氧化劑溶液。每個樣品平行測定三次。熒光下的面積衰變曲線（AUC）計算為：

注：f0為初始熒光讀數(shù)時間 0分，fi是熒光讀數(shù)的時間 i分。

對應(yīng)一個樣品的凈AUC計算如下：

計算出net AUC和Trolox濃度之間的線性回歸方程。樣品最終的ORAC值表示為μmoL的TE（Trolox當(dāng)量）/g的抗氧化劑。

1.3.4.2 ABTS自由基清除能力法（Trolox equivalent antioxidant capacity）

ABTS自由基清除能力的測定參照文獻(xiàn)[11]的方法。ABTS自由基清除能力法又稱TEAC法。7 mM ABTS溶液與2.45 mM過硫酸鉀等體積混合，在室溫下放置 12～16 h 從而產(chǎn)生 ABTS·+。ABTS·+溶液采用50 mM pH=7.4 PBS稀釋至空白組A734nm=0.70±0.02。在96微孔板中按下列方式加樣后在30 ℃下反應(yīng)30 min，每6 min測定一次A734。每個樣品平行測定三次。

空白組：50 μL PBS+150 μL ABTS·+溶液；樣品組：50 μL 0.1 mg/mL 樣品+150 μL ABTS·+溶液。

其中，A0為空白組的吸光度值，AS為樣品組的吸光度值。

以不同濃度（20～180 μM）的Trolox與ABTS清除率做標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的ABTS清除率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求得的相當(dāng)于Trolox濃度的值就是TEAC值。

1.3.5 UPLC-MS/MS鑒定肽結(jié)構(gòu)[12]

將酶解產(chǎn)物溶于超純水中，濃度為0.1 mg/mL，進(jìn)樣到在線連接RP-UPLC T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）的電噴霧質(zhì)譜儀。進(jìn)樣量5 μL，流動相A為水-甲酸（1000:1，V/V），流動相B為乙腈，所采用的梯度洗脫流程如下：0～1 min，0% B；1～9 min，0%～30.0% B（線性梯度）；9～10 min，30.0% B（等量洗脫）；10～13 min，30.0%～0% B（線性梯度）；13～15min，0% B；流速：0.50 mL/min；檢測波長：220 nm。樣品以100 μL/min的流速進(jìn)入質(zhì)譜儀，采用正離子掃描模式，霧化氣和干燥氣為高純氮氣，掃描范圍為質(zhì)/核比 100～2000 u。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

所有的測定均重復(fù)三次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 20.0（SPSS Inc.,Chicago IL, USA）進(jìn)行單因素方差分析，并以Duncans多重比較法進(jìn)行顯著性差異的分析（p＜0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 鱸魚蛋白酶解產(chǎn)物的酶解制備

2.1.1 不同蛋白酶酶解鱸魚的酶解產(chǎn)物的水解度（DH）

圖1 不同蛋白酶酶解鱸魚的酶解產(chǎn)物的水解度Fig.1 DH values of different enzymatic hydrolysates of bass

5種蛋白酶酶解鱸魚得到的酶解產(chǎn)物水解度如圖1所示，木瓜蛋白酶的水解度最高，為25.61%，但與復(fù)合蛋白酶（23.63%）無顯著性差異，明顯高于Alcalase 2.4 L和風(fēng)味蛋白酶（分別為 22.85%和18.70%）。木瓜蛋白酶與復(fù)合蛋白酶水解度高有可能是由于這兩種酶的酶切位點比較廣，可以更好地水解鱸魚蛋白，水解過程當(dāng)中產(chǎn)生了更多小分子肽以及游離氨基酸[13]。

2.1.2 不同蛋白酶酶解鱸魚的酶解產(chǎn)物的蛋白回收率

圖2 不同蛋白酶酶解鱸魚的酶解產(chǎn)物的蛋白回收率Fig.2 Protein recovery rates of different enzymatic hydrolysates of bass

從圖2可以看出，不同蛋白酶酶解得到的酶解產(chǎn)物蛋白回收率有顯著性差異（p＜0.05）。其中酶解產(chǎn)物蛋白回收率從高到低依次所用的酶是木瓜蛋白酶＞Alcalase 2.4 L＞中性蛋白酶＞復(fù)合蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶。由于酶自身的特異性，使之與蛋白底物的作用位點存在較大區(qū)別，因而各自水解得到的多肽數(shù)量有較大差別[14]。

2.1.3 不同蛋白酶酶解鱸魚的酶解產(chǎn)物的抗氧化活性

2.1.3.1 不同蛋白酶酶解鱸魚的酶解產(chǎn)物的ORAC值

圖3 不同蛋白酶酶解鱸魚的酶解產(chǎn)物的ORAC值Fig.3 ORAC values of different enzymatic hydrolysates of bass

從圖3可知，不同蛋白酶對酶解產(chǎn)物的ORAC值有顯著性差異（p＜0.05），五種蛋白酶酶解得到的酶解產(chǎn)物均有一定的ORAC值，說明蛋白酶可有效水解鱸魚中的蛋白，釋放多肽，使之展現(xiàn)良好的抗氧化活性。其中，木瓜蛋白酶的ORAC值最高，為783.56 μmol TE/g，明顯高于風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶及Alcalase 2.4 L。

2.1.3.2 不同蛋白酶酶解鱸魚的酶解產(chǎn)物的TEAC值

圖4 不同蛋白酶酶解鱸魚的酶解產(chǎn)物的TEAC值Fig.4 TEAC values of different enzymatic hydrolysates of bass

從圖4可知，5種蛋白酶酶解鱸魚得到的鱸魚多肽均具有一定的TEAC值，木瓜蛋白酶的TEAC值最高，為734.55 μmol TE/g，明顯高于風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶及Alcalase 2.4 L。

木瓜蛋白酶酶解鱸魚得到的鱸魚多肽的抗氧化活性最高，這個可能是由于木瓜蛋白酶酶解鱸魚產(chǎn)生了更多含有抗氧化氨基酸的肽段，此外，木瓜蛋白酶的DH也為最高，表明抗氧化活性和DH有關(guān)，因為鱸魚魚肉蛋白本身的結(jié)構(gòu)使得其只有很小的抗氧化性，而酶水解后打斷了這種緊密地結(jié)構(gòu)，使得具有抗氧化性的活性氨基酸殘基以及肽鏈暴露在外邊，大大增強(qiáng)了其抗氧化能力。

不同蛋白酶均能有效水解鱸魚，所得酶解產(chǎn)物的抗氧化活性不同，這可能是由于不同的蛋白酶酶切位點有差異，酶解得到的多肽分子量和序列不同，所以活性也會不一樣[18]。其中木瓜蛋白酶所得酶解產(chǎn)物抗氧化活性最優(yōu)。因而，本文進(jìn)一步采用UPLC-MS/MS分析鑒定木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，并驗證所得肽段的抗氧化活性。

2.2 鱸魚抗氧化肽的結(jié)構(gòu)鑒定

圖5 木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的BPC譜圖Fig.5 Base peak chromatogram (BPC) of papain enzymatic hydrolysates

圖6 木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的UV譜圖Fig.6 UV chromatogram at 220 nm of papain enzymatic hydrolysates

將木瓜蛋白酶酶解得到的鱸魚酶解產(chǎn)物通過UPLC-MS/MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。圖5和圖6呈現(xiàn)了木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的BPC (base peak chromatogram)譜圖及在220 nm處的UV譜圖。UV譜圖中2 min處有一個主峰，經(jīng)后續(xù)質(zhì)譜鑒定這個峰是Tyr。由于Tyr含有苯環(huán)，在紫外區(qū)有很強(qiáng)的吸收，從而會對其他在紫外區(qū)響應(yīng)較弱的物質(zhì)造成掩蔽效應(yīng)。游離的Tyr也具有一定的抗氧化活性，可能對木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的抗氧化活性有貢獻(xiàn)。

搜索MASCOT數(shù)據(jù)庫，得到的鱸魚酶解肽序列如表1所示。搜庫一共得到9條肽段，最短為8肽，最長為17肽，其中6條肽段來源于小清蛋白，2條肽 段來源于肌球蛋白輕鏈，1條肽段來源于α-肌動蛋白。

表1 搜庫得到的鱸魚酶解肽序列Table 1 The sequence of peptides contained in the bass protein hydrolysates

2.3 鱸魚酶解肽的抗氧化活性驗證

圖7 搜庫得到的多肽序列的抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of the synthetic peptides

搜庫得到的9條肽段中，有6條肽段沒有抗氧化活性，只有3條肽段展現(xiàn)出顯著的抗氧化活性，分別為EYGTVVVFQ，HRDRLCVVQ和GGGAGMLLK，其抗氧化活性如圖7所示。對比這3條肽段和谷胱甘肽（GSH）的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)：GSH的TEAC值最高，為 2.72 μmol TE/μmol，EYGTVVVFQ 次之，為2.34 μmol TE/μmol，HRDRLCVVQ 再次之，為 1.38μmol TE/μmol，GGGAGMLLK 沒有 ABTS 自由基清除能力；3條肽段的ORAC值都高于GSH。對比Trolox可以看出，3條肽段的TEAC值都強(qiáng)于Trolox（＞1.0 μmol TE/μmol）；對于ORAC值，EYGTVVVFQ高于Trolox（＞1.0 μmol TE/μmol），HRDRLCVVQ 和GGGAGMLLK比Trolox低。

EYGTVVVFQ中Tyr因含酚羥基可作為氫供體，可抑制由自由基引發(fā)的過氧化鏈反應(yīng)。HRDRLCVVQ中Cys具有一個巰基（-SH），該基團(tuán)上的氫原子非?；顫姡梢灾苯忧宄杂苫?。GGGAGMLLK中Met上的S原子可以提供電子從而被氧化成Met亞砜，此外，它們由于具有共振結(jié)構(gòu)而能維持抗氧化的穩(wěn)定性。這些特點可能是這 3條肽段具有抗氧化活性的原因[15～18]。

3 結(jié)論

通過水解度、蛋白回收率和抗氧化活性的測定，確定制備鱸魚酶解產(chǎn)物的最佳水解酶為木瓜蛋白酶。將木瓜蛋白酶水解得到的鱸魚酶解產(chǎn)物通過UPLC-MS/MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，然后通過UniProt中的鱸魚蛋白庫進(jìn)行搜庫，得到9條多肽，體外合成這9條多肽并測定它們的抗氧化活性，其中EYGTVVVFQ，HRDRLCVVQ和GGGAGMLLK顯示出一定的抗氧化活性。本實驗中獲得的鱸魚酶解肽研究結(jié)果為其應(yīng)用研究提供一定的科學(xué)理論依據(jù)。例如根據(jù)鱸魚酶解肽的抗氧化性，可以將其作為天然的防止食品腐敗變質(zhì)的添加劑應(yīng)用到食品中，以取代化學(xué)合成的防腐劑；也可將其作為抗衰老成分添加到化妝品中發(fā)揮養(yǎng)顏和延緩衰老的作用。