菠蘿酒中SO2天然替代物的篩選及其抗氧化機(jī)理的分析

張大為，張潔，閆佳，田永航，裴志勝

（海南熱帶海洋學(xué)院生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院，海南省海洋食品工程技術(shù)研究中心，海南三亞 572022）

果酒釀造過程中，SO2作為添加劑一直沿用至今，主要在釀造、存儲等環(huán)節(jié)中起到抗菌和抗氧化兩個作用[1～3]。在果酒中SO2主要抑制酪氨酸酶、過氧化物酶、多酚氧化酶等引起的酶促褐變及非酶促褐變，保護(hù)了果酒中多酚等還原性物質(zhì)，進(jìn)而減少酒體的氧化程度[4～7]。另一個方面SO2能夠抑制果酒中腐敗菌（包括野生酵母、有害乳酸菌和醋酸菌）的生長，主要通過與腐敗菌結(jié)構(gòu)蛋白中的酶、輔酶、核酸等物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)來起到防腐殺菌的作用[8]。

盡管SO2在果酒中能夠起到抗菌和抗氧化作用，但據(jù)報道它也會給人類的健康造成影響。大量研究結(jié)果表明，SO2能引起諸多包括皮炎、蕁麻疹、血管性水腫、腹瀉、腹痛、支氣管狹窄和過敏反應(yīng)等能使動物出現(xiàn)胃部發(fā)生病變、硫胺素缺乏及生長緩慢等健康問題。人體尤其是敏感人群對過量SO2會出現(xiàn)過敏反應(yīng)，超過1 mg的計量時，就會出現(xiàn)哮喘等問題，大約占總過敏人群的4～10%。鑒于此，國際葡萄與葡萄酒組織（OIV）建立了包括葡萄酒在內(nèi)的果酒中二氧化硫含量的最高限量，當(dāng)超過10 mg/L的計量時就要表明具體含量，總殘留量不能超過50 mg/L，我國對此也有明確的限制，釀造過程中最大使用量不能超過250 mg/L。故找到能夠替代SO2的替代品和方法已成為果酒生產(chǎn)者和研究者的當(dāng)務(wù)之急，已成為生產(chǎn)安全綠色果酒的關(guān)鍵問題之所在[9～13]。

找到能夠替代SO2抗菌和抗氧化作用的物質(zhì)將是行之有效的辦法。中草藥是中華民族的瑰寶，眾多中草藥都含有豐富的抗菌成分及抗氧化成分，所以以中草藥為篩選源，從中找到在果酒中既起抗菌作用又起抗氧化作用中草藥在理論上是可行的，從而使減少果酒加工和存儲過程中SO2的用量。本研究選取多種中草藥作為篩選源，以菠蘿酒為例，考察其在酒中的抗菌和抗氧化作用，希望找到能夠減少菠蘿酒中SO2用量的抗菌劑和抗氧化劑，并對其抗氧化機(jī)理進(jìn)行初步研究，為生產(chǎn)出不加SO2的天然果酒奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要設(shè)備

菠蘿汁：購買市售新鮮的香水菠蘿，制備梨汁，調(diào)整糖度為15 Brix，備用；中草藥：購于中藥店或采于野外；釀造菌株Saccharomyces cerevisiaeDJ02：保存于實(shí)驗(yàn)室。

主要試劑：福林酚試劑，上海荔達(dá)生物科技有限公司；DPPH（2,2-Diphenyl-1-hydrazyl），Sigma公司；Tris（三羥基氨基甲烷，Tris-hydroxymethy aminomethane），上海山浦化工有限公司；鄰苯三酚（焦性沒食子酸，Pryrogallic acid），貴州遵義佳宏化工有限責(zé)任公司；亞硫酸等其他試劑均為分析純，由華星試劑公司代購。

主要設(shè)備：SP-752（PC）型紫外可見風(fēng)光光度計，上海光譜儀器有限公司；ZDJ-4A型自動電位滴定儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法及內(nèi)容

1.2.1 中草藥的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)資料及前期研究工作，選擇具有潛在高效抗氧化性能、抗菌性能的27種中草藥為研究對象，作為篩選源。

1.2.2 中草藥提取物的制備

每種樣品稱量2 g加入100 mL三角瓶中，加水20 mL，隔水蒸15 min，過濾分裝，冷卻，保存至4 ℃的冰箱，備用。

1.2.3 菠蘿酒釀造工藝

圖1 菠蘿酒釀造工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of pineapple wine brewing

1.2.4 菠蘿酒發(fā)酵

取100 mL菠蘿汁至于150 mL發(fā)酵瓶中，加入定量中草藥提取物，其中對照組加入3 mL亞硫酸。于27 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵，前酵時間為8 d。

1.2.5 抗菌實(shí)驗(yàn)

采用紫外可見分光光度計SP-752（PC）在波長為570 nm條件下，定期測定各組菠蘿酒的吸光度值，以添加SO2的樣品為標(biāo)準(zhǔn)對照（即每次測定吸光度以添加SO2的樣品作為零點(diǎn)）[7]。

1.2.6 中藥提取物定量實(shí)驗(yàn)

選取抗菌效果最好的中藥發(fā)酵到第5 d時，來確定提取物的最佳添加量。

1.2.7 菠蘿酒中總酚含量的測定

采用福林酚法測定菠蘿酒中總酚含量。具體操作如下：用移液管精確量取菠蘿酒樣品0.5 mL于50 mL容量瓶中，加入30 mL蒸餾水，搖勻，再加入2.5 mL福林酚試劑和7.5 mL 20%的Na2CO3溶液，用蒸餾水定容并混勻，75 ℃水浴反應(yīng) 10 min，冷卻后于波長760 nm處測吸光度。以添加SO2的樣品作為對照。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體操作為：準(zhǔn)確稱取0.1 mg/mL的沒食子酸0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL于50 mL容量瓶中，各加30 mL水，后續(xù)按上述方法操作[14]。

1.2.8 釀造菌株對SO2替代物的適應(yīng)性

通過上述篩選，將具有高效抗氧化和抗菌性能的中藥提取物加入到菠蘿酒中，考察釀造菌株對其適應(yīng)性，從而找到最適合菠蘿酒發(fā)酵的SO2替代物。

1.2.9 SO2替代物抗氧化機(jī)理的初步探討

1.2.9.1 菠蘿酒氧化還原電位的測定

采用ZDJ-4A型自動電位滴定儀配合恒溫攪拌器測定[15]。

1.2.9.2 多酚相對聚合度的測定

（1）FD值的測定：FD試劑的配制：在150 mL蒸餾水中，加入20 g鎢酸鈉、4 g磷鉬酸、10 mL磷酸，回流2 h，冷卻，稀釋至200 mL。于100 mL容量瓶中依次加入2 mL樣品、2 mL FD試劑和4 mL 20%的碳酸鈉溶液，混勻后定容，于室溫下放置1 h后于760 nm處測定吸光度值。（2）V值的測定：于10 mL容量瓶中依次加入2 mL樣品、3 mL 1%香草醛乙醇溶液和4 mL濃鹽酸，混勻后定容，于室溫下放置30 min后于500 nm處測定吸光度值[16]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均采用平均值（Mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。采用Excel 2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行畫圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 中草藥抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 中草藥抗菌結(jié)果Fig.2 Antibacterial results of Chinese herbal medicine

27種中藥經(jīng)過測試發(fā)現(xiàn)，有7種在菠蘿酒中具有良好的抗菌特性，如圖2所示。從空白曲線可以看出，酒中微生物生長曲線符合單細(xì)胞生長規(guī)律，這與果酒中腐敗菌主要是野生酵母、乳酸菌、醋酸菌的結(jié)論是一致的。圖中7種中藥與空白組相比，都具有抗菌的作用，從第1 d到第3 d的延滯期內(nèi)菌量緩慢上升，第3 d到第4 d的對數(shù)生長期內(nèi)呈緩慢上升的趨勢，但是與空白組相比，上述速度顯著降低。第5 d以后進(jìn)入穩(wěn)定期，較對空白組來說，進(jìn)入穩(wěn)定期延長1 d。說明這7種中藥均具有較顯著抑制雜菌的作用。從圖2可以看出，添加酸棗仁之后，菠蘿酒在整個發(fā)酵過程中的吸光度A570nm均在0.001～0.141之間，與添加SO2的菠蘿酒最為接近，故酸棗仁的抗菌效果最好，地菜子次子，具有潛在替代菠蘿酒中SO2抗菌作用的能力。

2.2 中草藥提取物定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 酸棗仁加量對抗菌結(jié)果的影響Fig.3 Effect of the amount of semen zizyphi spinosae on antibacterial results

在菠蘿汁中加入抗菌效果最好的酸棗仁，在發(fā)酵第5 d后檢測其抗菌性能。如圖3所示，添加量從1.5 mL/100 mL～4 mL/100 mL，發(fā)酵酒液在570 nm波長下的吸光度呈先下降后上升的趨勢。中藥提取物在 2.5 mL/100 mL的加量時，吸光度最低，即含菌量最低，抗菌效果最好。

2.3 福林酚法測定菠蘿酒中總酚含量的結(jié)果

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

所得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示，由上數(shù)據(jù)可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線所對應(yīng)的方程如下：

式中：y-吸光度值；x-總酚含量（μg/mL）。

圖4 總酚含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of total polyphenol content determination

表1 沒食子酸含量及對應(yīng)吸光度值Table 1 Gallic acid content and the corresponding absorbance values

2.3.2 以中草藥作為抗氧化劑的菠蘿酒中總酚含量的測定結(jié)果

圖5 菠蘿酒中總多酚含量的變化曲線Fig.5 Change curve of the whole polyphenol content in the pineapple wine

從圖5可以看出，菠蘿酒在添加SO2、地菜子和酸棗仁之后，總多酚含量在發(fā)酵前3 d之內(nèi)下降比較明顯，其中地菜子在第4 d之前下降比較明顯。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，多酚含量趨于穩(wěn)定。從圖可以看出，菠蘿酒在添加酸棗仁和地菜子后的多酚含量都與添加SO2的相接近，均具有替代SO2抗氧化作用的潛力。酸棗仁在菠蘿酒中的抗氧化作用要強(qiáng)于地菜子，故本實(shí)驗(yàn)可以確定酸棗仁的抗氧化作用最強(qiáng)。

2.4 SO2替代物對釀造用菌種 Saccharomyces cerevisiae DJ02的影響

圖6 SO2替代物對釀造菌種Saccharomyces cerevisiae DJ02的影響Fig.6 Effect of SO2 substitution on Saccharomyces cerevisiae DJ02

菠蘿汁經(jīng)過121 ℃、15 min滅菌冷卻后分別加入地菜子和酸棗仁提取物，本實(shí)驗(yàn)為了確定地菜子和酸棗仁提取物對釀造用菌株Saccharomyces cerevisiaeDJ02的影響，以此來確定適合于菠蘿酒釀造的替代物。以SO2和不加任何添加物來酒樣作為對照組。如圖6所示，酒樣中添加SO2、酸棗仁和地菜子后，均對Saccharomyces cerevisiaeDJ02的生長具有抑制作用?？瞻捉M中第2 d釀造菌株開始生長，標(biāo)志延滯期結(jié)束并開始進(jìn)入對數(shù)生長期，從第7 d開始進(jìn)入穩(wěn)定期。與對照組相比添加SO2、酸棗仁和地菜子的三種酒樣中，釀造菌株均在第2 d到第3 d之間開始生長，比空白組稍晚，隨后生長進(jìn)入對數(shù)生長期。在第 6 d之前加入SO2和酸棗仁的酒樣中的釀造菌株生長與空白組相比沒有被明顯抑制，但其在加入地菜子中受到較明顯的抑制作用。如圖6所示，在發(fā)酵第7 d以后，菌株生長到達(dá)穩(wěn)定期，與空白組相比，其生長均不同程度地受到SO2、酸棗仁和地菜子的影響，酸棗仁和地菜子對Saccharomyces cerevisiaeDJ02生長的影響比SO2都小，說明兩者均適合于菠蘿酒的發(fā)酵。但是，從整個發(fā)酵過程來看，地菜子的添加相對于酸棗仁來說延長了釀造菌株的延滯期，表明在發(fā)酵前期地菜子抑制作用比較明顯。綜合來看，酸棗仁更適合于菠蘿酒的釀造過程。

2.5 酸棗仁在菠蘿酒中的抗氧化機(jī)理分析

2.5.1 菠蘿酒中氧化還原電位測定結(jié)果

圖7 菠蘿酒中氧化還原電位的測定結(jié)果Fig.7 Determination results of the oxidation-reduction potential(Eh) in pineapple wine

氧化還原電位可以間接地反應(yīng)菠蘿酒的氧化程度，氧化還原電位低，說明還原性較強(qiáng)，氧化性較弱。從圖7可以看出，未加酸棗仁的空白組酒樣，其氧化還原電位隨著時間的延長呈上升的趨勢，而菠蘿酒中的多酚含量卻呈逐漸降低的趨勢，說明其氧化程度在加深。在添加了酸棗仁提取物以后，菠蘿酒的氧化還原電位逐漸減低，說明其被氧化的程度較低。綜上所述，酸棗仁提取物的添加可以降低菠蘿酒的氧化還原電位，延緩多酚類物質(zhì)的氧化。

2.5.2 菠蘿酒中多酚聚合度的測定結(jié)果

果酒被氧化主要是非酶褐變，非酶褐變主要分為兩步。第一步是酚類物質(zhì)的氧化，尤其是具有鄰羥基結(jié)構(gòu)的多酚最容易被氧化。在氧氣和銅鐵等金屬離子的參與下，鄰羥基酚被氧化生成鄰醌或半醌自由基，同時氧被還原為過氧化氫。這一步中生成的醌類物質(zhì)很不穩(wěn)定，它能夠自發(fā)地與菠蘿酒中的親和物質(zhì)相結(jié)合，生成二聚體或多聚體。醌酚二聚體通過分子結(jié)構(gòu)重排，可以產(chǎn)生新的二酚二聚體，新生成的二酚二聚體或多聚體比之前未聚合的多酚更容易發(fā)生氧化反應(yīng)，從而更容易引起酚類物質(zhì)的氧化聚合，生成更多的過氧化氫。過氧化氫在金屬離子的作用下，發(fā)生Fenton反應(yīng)，生成羥自由基。羥自由基具有極強(qiáng)的氧化性，但由于它存在的時間極短、作用半徑也比較小，故最容易與菠蘿酒中濃度較高的乙醇發(fā)生反應(yīng)，將其氧化為乙醛。乙醛可以與黃烷醇類化合物反應(yīng)，生成黃烷醇二聚體或三聚體，進(jìn)而生成更加復(fù)雜的多聚體，從而使菠蘿酒的氧化程度加深。

圖8 菠蘿酒中多酚相對聚合度的測定結(jié)果Fig.8 Determination results of the relative polymerization of polyphenols in pineapple wine

從圖8中可以發(fā)現(xiàn)，與未添加酸棗仁的菠蘿酒相比，加入了酸棗仁提取物后，菠蘿酒中多酚的相對聚合度有明顯的降低，從而減少羥自由基的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制菠蘿酒中多酚的氧化。

3 結(jié)論

酸棗仁和地菜子在菠蘿酒發(fā)酵中具有較好的抗菌和抗氧化性能，其中酸棗仁的抗菌和抗氧化性能較強(qiáng)，具有替代 SO2的潛力。酸棗仁的最佳添加量為 2.5 mL/100 mL。酸棗仁應(yīng)用于菠蘿酒發(fā)酵中，其對釀造菌株Saccharomyces cerevisiaeDJ02的影響相對于地菜子和SO2較小。酸棗仁加入到菠蘿酒中以后，菠蘿酒的氧化還原電位降低，從而減少酒體氧化；菠蘿酒加入酸棗仁以后，使得菠蘿酒中的多酚聚合度降低，進(jìn)而延緩了氧化速度。