紫蕪菁乙醇提物對Caco-2細胞氧化損傷的保護作用

宋家樂，錢波，王程強，曾榛，桂中玉，周燕園

（1.桂林醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，廣西桂林 541100）（2.東南大學公共衛(wèi)生學院，江蘇南京 210009）（3.廣西高校預防醫(yī)學重點實驗室，廣西桂林 541100）（4.桂林醫(yī)學院藥學院，廣西桂林 541100）

紫蕪菁(Brassica rapavarL)又稱蔓菁、大頭菜、卜留克或恰瑪古(維吾爾語)，屬十字花科蕓苔屬蕪菁種兩年生植物，主產(chǎn)地為我國新疆、西藏和東北地區(qū)，目前全國范圍內(nèi)都有種植。蕪菁是傳統(tǒng)的藥食同源植物，其食用部分為地下肉質(zhì)根。研究發(fā)現(xiàn)，蕪菁含有豐富的多糖、皂苷、酚類、硫代葡萄糖苷類化合物及揮發(fā)油等功能性成分[1]，具有抗衰老[2]、抗缺氧[3,4]、體內(nèi)抗氧化[5]、抗腫瘤[6]和降血糖功效[7,8]等功效。

過度的氧化應激所導致的各種組織和細胞中細胞膜結(jié)構(gòu)的改變，細胞代謝酶類和功能蛋白失活、遺傳物質(zhì)的損傷以及細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應都是各種退行性疾病發(fā)生的主要原因[9]。在人體中，腸道不僅僅擔負有消化功能，同時也是氧化應激損傷的主要靶器官之一。氧化應激會擾亂小腸上皮細胞的正常生理功能，造成其所構(gòu)成的物理性腸道屏障功能喪失，并導致腸腔內(nèi)細菌、毒素及其他有害物質(zhì)進入血液系統(tǒng)引發(fā)腸道潰瘍，結(jié)腸炎并直接造成結(jié)-直腸癌等重大疾病的發(fā)生[10]。

目前，就紫蕪菁對于腸道上皮細胞氧化應激損傷后的保護作用的研究鮮見報道。人結(jié)腸癌Caco-2細胞因其存在有與正常小腸上皮細胞類似的緊密連接、微絨毛等相關結(jié)構(gòu)，并具有相關代謝酶系和分泌功能等特點而被認為是一株用于研究腸道屏障損傷與修復機制的經(jīng)典細胞系[11]。因此，本實驗擬利用 H2O2處理Caco-2人結(jié)腸癌上皮細胞制備細胞氧化損傷模型，研究紫蕪菁乙醇提取物對細胞氧化損傷的保護并探討可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、脫氧核糖、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、過氧化氫(H2O2)、抗壞血酸、脫氧核糖和叔丁基對苯二酚(tertiary butylhydroquinone，TBHQ)：美國Sigma公司；DMEM 高糖型細胞培養(yǎng)液、青霉素-鏈霉素雙抗、胰蛋白酶-EDTA消化液、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、2’,7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)：美國Thermo Scientific公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒：南京建成生物工程研究所；IL-1β與IL-8試劑盒：美國Cloud colon公司；Bio-Rad Quick Start Bradford試劑盒：美國Bio-Rad公司。其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。新鮮紫蕪菁樣品購自桂林市蔬菜科學研究所。

1.2 儀器與設備

EYELA N-1001S真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：東京理化器械株式會社；Biotek Elx808酶標儀：美國伯騰儀器有限公司；756S紫外可見光分光光度計：上海棱光技術有限公司；Thermo 3110二氧化碳細胞培養(yǎng)箱：美國Thermo公司；AL204電子分析天平：梅特勒-托利多公司上海有限公司；電熱恒溫水浴鍋HWS-28：上海一恒科學儀器有限公司；FLUOstar OPTIMA熒光酶標儀：德國BMG公司。

1.3 實驗細胞株

Caco-2人結(jié)腸腺癌細胞系(源自中國科學院上海細胞資源中心)由桂林醫(yī)學院生物技術學院鄒先瓊教授饋贈。

1.4 紫蕪菁乙醇提取物的制備

新鮮紫蕪菁可食部去除雜葉后，以雙蒸水沖洗并行真空冷凍干燥。凍干的紫蕪菁經(jīng)粉碎后過60目篩備用。取紫蕪菁粉(100 g)中加入500 mL乙醇后在室溫條件下攪拌浸提6 h。濾液經(jīng)3000 r/min離心15 min后棄渣收集上清，50 ℃真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，制成紫蕪菁乙醇提取物(收率為41.2%)，-80 ℃儲存待用。

1.5 紫蕪菁乙醇提取物的體外抗氧化能力

1.5.1 DPPH自由基清除能力測定

在 100 μL不同濃度的紫蕪菁乙醇提取物中加入等量的DPPH標準液(150 μmol/L)后混勻，室溫避光處反應30 min，酶標儀測定517 nm處值并計算清除率。清除率(%)=[1-(A樣品組-A樣品空白組)/A空白組]×100%。

1.5.2 ·OH自由基清除能力測定

不同濃度的紫蕪菁乙醇提取物(200 μL)中，分別加入脫氧核糖(60 mmol/L)，H2O2(10 mmol/L)，PBS(50 mmol/L，pH 7.5)，氯化鐵溶液(1 mmol/L)，EDTA溶液(1.04 mmol/L)和抗壞血酸溶液(4 mmol/L)各 200 μL。37 ℃水浴1 h后，加入1% TBA溶液(1 mL)和2.8%TCA 溶液(1 mL)并繼續(xù)在 90 ℃水浴條件下反應 30 min后用分光光度計測定 OD532nm值計算清除率。清除率(%)=[1-(A樣品組-A樣品空白組)/A空白組]×100%。

1.5.3 總還原力測定

適量樣品用PBS(20 mmol/L，pH 6.6)配成1 mL的樣品液后，加入1 mL鐵氰化鉀溶液(10 mg/mL)混勻。50 ℃水浴中孵育20 min后加入200 μL的TCA溶液(100 mg/mL)，3000 r/min條件下離心10 min。上清液(0.5 mL)中加入等量蒸餾水和0.1 mL的氯化鐵溶液(1 mg/mL)混勻，分光光度計測定OD700nm值。

1.6 紫蕪菁乙醇提取物對細胞氧化損傷的保護效果

1.6.1 細胞培養(yǎng)及分組

Caco-2細胞用DMEM細胞培養(yǎng)液(含10%FBS與1%青-鏈霉素雙抗液)置于37 ℃、5% CO2環(huán)境下濕化培養(yǎng)。細胞貼壁長至培養(yǎng)皿80%時，胰蛋白酶-EDTA液按比例消化傳代，取指數(shù)期細胞用于實驗。以DMEM培養(yǎng)液(含150 μmol/L的H2O2)處理細胞4 h制備損傷細胞模型。模型細胞以不同質(zhì)量濃度的紫蕪菁乙醇提取物(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h并進行后續(xù)實驗。正常組為未經(jīng)過任何處理的正常Caco-2細胞。

1.6.2 MTT法測定細胞存活率及LDH脫氫酶水平

細胞按前述分組處理并進行24 h培養(yǎng)后，棄孔內(nèi)培養(yǎng)基并加入終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的MTT試劑(100 μL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清液，每孔加入DMSO(100 μL)避光振蕩30 min，測定OD490nm后按公式：細胞生存率(%)=OD樣品組/OD正常組×100來計算細胞生存率。

1.6.3 樣品對細胞內(nèi)MDA生成量的測定

細胞用預冷的PBS沖洗3次，細胞刮刀收集細胞后，加入細胞裂解液在冰上裂解細胞。細胞裂解液(500 μL)與反應液(15%的TCA與0.67%TBA混合液，400 μL)充分混勻后在95 ℃水浴中孵育20 min。待冷卻后，加入異丙醇(3 mL)提取色素并測定OD532nm，試劑盒定量細胞總蛋白量。按照公式 MDA 生成量/(μmol/mg protein)=[MDA含量(μmol/mL)×1.5 mL]/總蛋白質(zhì)含量(mg)計算MDA生成量。

1.6.4 樣品對細胞內(nèi)ROS水平的測定

依前述處理細胞后，加入 DMEM 培養(yǎng)液(DCFH-DA，20 μmol/L)在 37 ℃條件下孵育 20 min，PBS沖洗細胞2次后收集細胞。在激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為530 nm的條件下用FLUOstar OPTIMA熒光酶標儀測定熒光強度，按照公式：相對ROS水平/%=熒光強度樣品處理組/熒光強度正常組×100 進行計算。

1.6.5 樣品對細胞內(nèi)抗氧化物酶(SOD、CAT和GSH-Px)活力的測定

取適量經(jīng)過處理的細胞裂解液按照SOD、CAT和GSH-Px測定試劑盒說明書步驟操作。細胞內(nèi)總蛋白用Bio-Rad蛋白質(zhì)定量試劑盒測定。細胞內(nèi)抗氧化物酶活力用細胞內(nèi)總蛋白量進行校正并以酶比活力單位(U/mg pro)表示。

1.6.6 樣品對細胞內(nèi)炎性細胞因子 IL-1β與IL-8分泌水平的測定

細胞接種到培養(yǎng)板并依前述方法處理后，4 ℃下收集細胞培養(yǎng)上清液。取適量培養(yǎng)上清液按照 IL-1β與 IL-8測定試劑盒說明書步驟操作并用細胞總蛋白質(zhì)含量作校正。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

本研究中，所有實驗均重復 3次，結(jié)果以均值(means)±標準偏差(SD)表示。所得實驗數(shù)據(jù)運用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析與統(tǒng)計處理，p＜0.05為具有統(tǒng)計差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫蕪菁乙醇提取物的體外抗氧化能力

圖1 紫蕪菁乙醇提取物的體外DPPH(a)和·OH(b)自由基的清除能力與總還原力(c)Fig.1 The radical scavenging (DPPH and ·OH) activities and total reducing power of BREE in vitro

DPPH自由基清除能力實驗是一種常用于檢測物質(zhì)是否具有抗氧化性的體外定性實驗[7]?！H自由基除本身的化學性質(zhì)活潑之外，還具有極強的生物大分子破壞力。紫蕪菁乙醇提取物對DPPH和·OH自由基都具有較好的清除能力，且清除力隨提取物質(zhì)量濃度的增高而增加顯著(圖1)。其中，較高濃度的紫蕪菁乙醇提取物(250 μg/mL 和500 μg/mL)清除DPPH的能力要略強于人工合成抗氧化劑TBHQ。而·OH自由基清除能力方面，紫蕪菁乙醇提取物則要弱于 TBHQ(圖1b)。

具有較強還原能力的物質(zhì)依靠自身提供電子與自由基進行配對從而降低自由基活性可以從某種程度上間接反映出其體外抗氧化能力的強弱[8]。隨著紫蕪菁乙醇提取物濃度的增加，其總還原力也隨之增強，并呈現(xiàn)出劑量效應關系(圖1C)。但是，紫蕪菁乙醇提取物的總還原能力與TBHQ相比較弱。

2.2 紫蕪菁乙醇提取物的對H2O2所致Caco-2細胞生存率和細胞LDH釋放水平的影響

如表1所示，經(jīng)4 h的H2O2(150 μmol/L)直接處理后顯著造成Caco-2細胞生存率下降(p＜0.05)。而紫蕪菁乙醇提取物處理可以明顯改善受損細胞的生存率(表1)。紫蕪菁對受損Caco-2細胞的保護效果隨其乙醇提取物的質(zhì)量濃度增加而增強，并呈現(xiàn)出顯著的劑量效應關系(p＜0.05)。在經(jīng) 100 μg/mL 和 200 μg/mL 的紫蕪菁乙醇提取物處理后，細胞的生存率分別達到75.6%和83.2%。生存率分別較未經(jīng)處理的模型細胞生存率增高1.56倍和1.72倍。正常情況下，乳酸脫氫酶(LDH)屬于一種穩(wěn)定存在細胞內(nèi)部的酶，一旦細胞遭受應激損傷后能迅速釋放到細胞外。因此，LDH是一種常用于衡量細胞激損傷后的生物指標物[9]。較正常細胞相比，H2O2(150 μmol/L)處理顯著造成Caco-2細胞內(nèi)的LDH外溢(p＜0.05)。而紫蕪菁乙醇提取物處理可以顯著抑制受損Caco-2細胞中LDH的溢出，且抑制效果存在顯著的劑量效應關系(p＜0.05)。高濃度紫蕪菁乙醇提取物(100 μg/mL和200 μg/mL)分別處理細胞后，細胞 LDH溢出水平分別較未經(jīng)處理的模型細胞LDH溢出水平降低43%和52%。

表1 紫蕪菁乙醇提取物對H2O2所致Caco-2細胞生存率和細胞LDH釋放水平的影響Table 1 Effects of BREE on the cell viability and LDH levels in intestinal Caco-2 cells treated with H2O2

2.3 紫蕪菁乙醇提取物對H2O2所致Caco-2細胞內(nèi)ROS水平和MDA含量的影響

細胞內(nèi)部過度蓄積的 ROS是造成細胞正常生理反應失調(diào)，也是引發(fā)DNA斷裂，造成細胞凋亡，甚至是細胞死亡的重要因素之一[10]。如表2示，H2O2(150 μmol/L)處理能顯著造成Caco-2細胞內(nèi)ROS水平升高(p＜0.05)。而經(jīng)不同濃度紫蕪菁乙醇提取物(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 和 200 μg/mL)處理后，細胞內(nèi)ROS生成水平呈顯著的下降趨勢。損傷細胞內(nèi) ROS水平在經(jīng)高濃度蕪菁乙醇提取物(200 μg/mL)處理后降至最低(238.98%)，即較模型細胞中ROS水平下降了34%。MDA是細胞內(nèi)不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應生成所產(chǎn)生的氧化終產(chǎn)物，也是常用于評估細胞氧化損傷的程度的生物指示物之一，具有較強的生物毒性[11]。H2O2顯著造成Caco-2細胞中MDA含量升高(p＜0.05)。經(jīng)不同濃度紫蕪菁乙醇提取物(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 和 200 μg/mL)處理后，受損細胞中所MDA含量呈遞減趨勢，且與模型組相比較具有顯著性差異(p＜0.05)。高濃度紫蕪菁乙醇提取物(100 μg/mL和200 μg/mL)分別處理細胞后，細胞中MDA水平分別較未經(jīng)處理的模型細胞中 MDA水平降低33%和37%。結(jié)果提示，紫蕪菁乙醇提取物能有效抑制氧化應激所致細胞脂質(zhì)過氧化反應并降低 ROS水平的升高。

表2 紫蕪菁乙醇提取物對H2O2所致Caco-2細胞內(nèi)ROS水平和MDA含量的影響Table 2 Effects of BREE on the ROS and MDA levels in intestinal Caco-2 cells treated with H2O2

2.4 紫蕪菁乙醇提取物對H2O2所致Caco-2細胞內(nèi)CAT、SOD和GSH-Px酶的影響

許多臨床疾病的發(fā)生往往與體內(nèi)過多的活性氧積聚所引發(fā)的氧化-抗氧化平衡失衡有關[12]。SOD、CAT和GSH-Px等細胞內(nèi)源性抗氧化物酶在生命體對抗氧化應激損傷過程中發(fā)揮著至關重要的作用[13]。如表 3所示，H2O2處理顯著抑制Caco-2細胞中SOD，CAT和GSH-Px的酶活性。相反，經(jīng)不同濃度紫蕪菁乙醇提取物處理24 h后，受損細胞內(nèi)SOD，CAT和GSH-Px等酶的活性逐漸增高，且較未經(jīng)紫蕪菁乙醇提取物處理過的損傷模型組相比具有顯著性差異(p＜0.05)。高濃度紫蕪菁乙醇提取物(100 μg/mL和200 μg/mL)分別處理細胞后，細胞中SOD水平分別較模型細胞中SOD水平增高1.52倍和1.61倍。SOD除可以直接清除細胞內(nèi)積聚的自由基，阻斷細胞膜多價不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，以此抑制MDA和4-羥基壬烯酸(4-hydroxynonenal，HNE)等細胞毒性物質(zhì)的生成[14]。在GHS-Px酶活力方面，高濃度紫蕪菁乙醇提取物(100 μg/mL和200 μg/mL)可使處理后細胞中GHS-Px水平分別較模型細胞中 GHS-Px水平增高1.63倍和1.72倍。細胞內(nèi)非酶性抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽(GSH)則能在GSH-Px的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸凸入赘孰模瑥亩鴧⑴c將有毒的過氧化物還原成羥基化合物過程。同時，GSH-Px還能與CAT一起促H2O2分解生成水，保障細胞正常生理功能，維持細胞相關結(jié)構(gòu)來對抗氧化應激損傷[15]。此外，高濃度紫蕪菁乙醇提取物(100 μg/mL和200 μg/mL)可使處理后細胞中CAT水平分別較模型細胞中CAT水平增高1.86倍和1.87倍。

表3 紫蕪菁乙醇提取物對H2O2所致Caco-2細胞內(nèi)CAT、SOD和GSH-Px酶的影響Table 3 Effects of BREE on the CAT, SOD and GSH-Px levels in intestinal Caco-2 cells treated with H2O2

2.5 紫蕪菁乙醇提取物對H2O2所致Caco-2細胞內(nèi)IL-1β和IL-8分泌水平的影響

如圖2所示，150 μmol/L的H2O2處理能顯著造成Caco-2上皮細胞內(nèi)炎性細胞因子IL-1β和IL-8的過度分泌(p＜0.05)。經(jīng)不同濃度(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL)的紫蕪菁乙醇提取物處理后，受損Caco-2細胞中IL-1β與IL-8的分泌被抑制，并呈現(xiàn)一定的劑量效應關系。其中，高濃度紫蕪菁乙醇提取物(100 μg/mL和200 μg/mL)可使處理后細胞中IL-1β水平分別較模型細胞中 IL-1β水平降低 45.9%和55.2%。在IL-8水平方面，高濃度紫蕪菁乙醇提取物可使處理后細胞中 IL-8水平分別較模型細胞中 IL-8水平降低52.3%和70.6%。IL-1β和IL-8等炎性細胞因子的過度活化是誘發(fā)腸道組織內(nèi)炎癥發(fā)生的重要因素之一[16,17]，同時也在潰瘍性結(jié)腸(ulcerative colitis)和克羅恩病(Crohn’s disease)這兩類主要的腸道炎癥疾患(intestinal bowel disease，IBD)及其IBD相關性結(jié)腸癌變(IBD associated colorectal carcinogenesis)的病理生理發(fā)生過程中扮演著非常重要的角色[18]。抑制IL-1β和IL-8炎癥細胞因子的過度表達，可以降低腸道組織炎性環(huán)境，緩解IBD癥狀并能降低IBD相關癌變的發(fā)生風險[19～21]。

圖2 紫蕪菁乙醇提取物對H2O2所致氧化損傷Caco-2細胞中IL-1β與IL-8分泌水平的影響Fig.2 Effects of BREE on the secretion levels of IL-1β and IL-8 levels in intestinal Caco-2 cells treated with H2O2

3 結(jié)論

本研究通過體外自由基清除實驗和總還原力測定來評估紫蕪菁乙醇提取物的體外抗氧化能力。利用H2O2誘發(fā)人小腸上皮Caco-2細胞氧化損傷模型來研究紫蕪菁乙醇提取物對氧化應激損傷細胞的保護作用。本研究結(jié)果提示紫蕪菁乙醇提取物對體外自由基(DPPH和·OH)具有較強的清除能力，并具有較強的總還原力。在細胞研究水平上，紫蕪菁乙醇提取物能顯著抑制H2O2所引起的Caco-2細胞死亡，提高受損細胞的生存率。此外，紫蕪菁乙醇提取物不僅能夠提高受損細胞中SOD、CAT和GSH-Px等三種重要內(nèi)源性抗氧化物酶活性，同時還能顯著抑制受損細胞中應激損傷標志物MDA和ROS的生成。本研究結(jié)果提示，增強細胞內(nèi)源性抗氧化物酶的活性可能是紫蕪菁乙醇提取物對氧化應激損傷細胞具有保護作用的潛在機制之一。在今后的研究中，應從分子層面針對紫蕪菁乙醇提取物是否對參與調(diào)控特定的信號通路以對抗外源刺激物所誘發(fā)的細胞氧化應激損傷展開研究。