牛蒡根提取物BP1對Ⅱ型糖尿病大鼠癥狀的改善作用

陳希瑞，宋歌，陳靠山

（山東大學(xué)生命科學(xué)院，山東濟(jì)南 250100）

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)通常指Ⅱ型糖尿病(TZDM)。2013年，楊文英教授在《新英格蘭雜志》發(fā)表研究顯示，我國成人糖尿病和糖尿病前期患病率分別為9.7%和15.5%，患病人數(shù)高達(dá)9240萬和1.482億，且發(fā)病率仍在逐年上升[1,2]。DM與多種病理生理機(jī)制相關(guān)，包括了肥胖、高血壓、脂質(zhì)代謝紊亂和胰島素抵抗等[3]。DM可引起各種并發(fā)癥，尤其是眼病、心血管病、腎病、神經(jīng)病變[4～10]，導(dǎo)致器官功能不全或衰竭，是糖尿病患者生命健康的主要危害。本世紀(jì)以來，對糖尿病的病因、病理及生理等方面的研究具有突破性進(jìn)展。同時，口服治療糖尿病藥物也有相應(yīng)的發(fā)展，除原有刺激胰島素分泌作用及加強(qiáng)外周糖利用相關(guān)的降血糖藥物外，不斷有新類型的藥物正在臨床試用[11]。但這類藥物可引發(fā)消化道癥狀、過敏、肝腎功能衰退以及甚至誘發(fā)充血性心力衰竭等多種疾病[12,13]。因此從中醫(yī)藥的角度來尋求更為安全有效的DM藥物具有極其現(xiàn)實(shí)的意義。

牛蒡（Arctium lappa L.）菊科牛蒡?qū)僦备刀晟笮筒荼局参?，其根鮮嫩多汁、營養(yǎng)豐富[14]；既是一種食材，也被作為一種中藥用于治療疾病[15,16]。相關(guān)研究表明牛蒡提取物通過清除體內(nèi)氧自由基，對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠起到一定保護(hù)作用[17]；牛蒡葉多糖通過清除DPPH自由基，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有較明顯的抑菌作用[18]；此外，牛蒡通過調(diào)節(jié) Bcl-2，Bax蛋白的表達(dá)而抑制心肌細(xì)胞凋亡保護(hù)心肌細(xì)胞[19]，牛蒡根水提物可以保護(hù)高血壓大鼠血管內(nèi)皮損傷[20]，牛蒡子苷元能明顯抑制大鼠C6膠質(zhì)瘤生長[21]等。

中醫(yī)治療糖尿病的歷史源遠(yuǎn)流長[22]，中醫(yī)將多飲、多食、多尿，久則身體消瘦或尿有甜味為主要癥狀的一類病癥稱為“消渴”。《名醫(yī)別錄》中記載牛蒡可“療汗出、中風(fēng)、面腫、消渴、逐水”。其中，消渴則指糖尿病的治療。諸多研究表明，中藥牛蒡?qū)μ悄虿〈笫笥幸欢ㄖ委熥饔?。如，牛蒡子苷可以延緩并減輕糖尿病微血管病變[23]；牛蒡子提取物可以減輕糖尿病大鼠腎臟病變[24]等。本文通過構(gòu)建糖尿病大鼠模型，研究牛蒡根提取物BP1對糖尿病大鼠空腹血糖的治療作用。本文意在研究牛蒡多糖對 TZDM 的治療作用，初步探究其作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用和后續(xù)制劑研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮牛蒡根，購于山東濟(jì)南大潤發(fā)超市；Wistar大鼠200 g～230 g（SCXK魯20130009），購于山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 儀器與試劑

離心機(jī)SIGMA 4K15；電子天平FA2004N，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯控溫水浴鍋GKC4，上海波洛實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；熒光定量PCR儀，賽默飛；羅氏血糖儀；Agilent 1100液相色譜儀，Agilent公司；Sephadex G-50葡聚糖凝膠，Pharmacia產(chǎn)品；鏈脲佐菌素（streptozotocin STZ），購于Sigma公司；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒，丙二醛（MDA）檢測試劑盒；引物合成，華大基因。

1.3 方法

新鮮牛蒡根自然晾干后，切片打粉，過40目篩，按照1:8固液比，80 ℃熱水浸提1.5 h，兩次后，合并提取液，抽濾并減壓濃縮至適當(dāng)體積，4倍95%乙醇醇沉過夜，8000 r/min離心15 min，復(fù)溶后8000 r/min離心15 min取上清液，經(jīng)過Sephadex G-50層析后，超純水洗脫，收集洗脫液后，冷凍凍干，采用苯酚-硫酸法測定樣品中寡糖含量90%以上[25]，得到牛蒡根提取物牛蒡多糖，并命名為BP1。

購買的大鼠適應(yīng)性飼喂1周后，于50只大鼠中隨機(jī)抽取6只為正常對照組，給予普通飼料喂養(yǎng)，剩余大鼠高脂高糖飼料喂養(yǎng) 4周后禁食 12 h，腹腔注射STZ 35 mg/kg，正常組給予相同劑量的檸檬酸緩沖液。72 h后尾尖采血測空腹血糖，糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn)為空腹血糖≥11.1 mmol/L。未成模大鼠再次注射 STZ 20 mg/kg，72 h后尾尖采血測空腹血糖。

對于已成模大鼠血糖穩(wěn)定2周后用于實(shí)驗(yàn)。選擇40只造模成功的大鼠，根據(jù)空腹血糖值，隨機(jī)分組：阿卡波糖組、模型對照組、BP1 400 mg/kg、600 mg/kg、800 mg/kg共6組，每組6只。各組間體重和空腹血糖值方差分析無統(tǒng)計學(xué)顯著差異。于給藥前及給藥后8周每周監(jiān)測體重和空腹血糖，并記錄各組大鼠死亡情況。給藥8周后，乙醚麻醉大鼠，心臟取血，全自動生化儀測血糖值、總膽固醇及甘油三酯；同時，摘取右腎、胰腺稱重后記錄，于10%的甲醛溶液中固定，石蠟包埋并HE染色做切片觀察，并電鏡觀察胰島β變化。

另一半組織保存在液氮中，用于RNA的提取并逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR所用引物如下表1所示[26]，測定數(shù)據(jù)以±s表示，應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行分析，p＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 引物列表Table 1 List of primers

2 結(jié)果與分析

2.1 牛蒡根提取物 BP1對糖尿病大鼠死亡率（%）的影響

表2為灌胃期間各組大鼠的死亡率統(tǒng)計。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白對照組無死亡情況，且行為活動比較正常；模型組死亡率較高，后期體能減弱，并發(fā)癥比較嚴(yán)重。阿卡波糖組的情況較好，但是后期仍有白內(nèi)障等并發(fā)癥出現(xiàn)。牛蒡根提取物低劑量組與中劑量組的情況較好，無死亡情況。

表2 牛蒡根提取物BP1對糖尿病大鼠死亡率（%）的影響Table 2 Effects of burdock root extract BP1 on the mortality(%) of diabetic rats(±s, n = 6)

表2 牛蒡根提取物BP1對糖尿病大鼠死亡率（%）的影響Table 2 Effects of burdock root extract BP1 on the mortality(%) of diabetic rats(±s, n = 6)

注：阿卡波糖組、牛蒡根提取物BP1分別以200 mg/kg、400 mg/kg、600 mg/kg、800 mg/kg三個劑量連續(xù)灌胃8周，空白對照組給予相同量的蒸餾水，對大鼠的外觀體征，行為活動，死亡數(shù)目等進(jìn)行統(tǒng)計(不同小寫英文字母代表顯著性差異p＜0.05)。

Group 0 w 1 w 2 w 4 w 6 w 8 w空白 0 0 0 0 0 0 Control 0 16.7 16.7 16.7 16.7 33.3a阿卡波糖 0 0 0 0 0 0c 400（低） 0 0 0 0 0 0c 600（中） 0 0 0 0 0 0c 800（高） 0 0 0 0 0 16.7b

2.2 牛蒡根提取物 BP1對糖尿病大鼠體重的影響

表3為灌胃期間各組大鼠的體重數(shù)值統(tǒng)計。在處理第0周時，除空白對照組，其余各組體重?zé)o明顯差異。在灌胃處理第三周后，各組大鼠體重開始出現(xiàn)顯著性差異，其中模型組體重呈持續(xù)下降趨勢，其余各組體重開始回升；在第8周時，模型組大鼠的平均體重僅為368.2 g，而案例組體重遠(yuǎn)高于模型組，分別為402.7 g、382.3 g及402.1 g。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明牛蒡根提取物BP1可以在一定程度上對大鼠的體重有維持并恢復(fù)的作用。

2.3 牛蒡根提取物 BP1對糖尿病大鼠空腹血糖的影響

表4為灌喂處理期間各組大鼠空腹血糖值變化情況。實(shí)驗(yàn)第0周時，各組大鼠空腹血糖無明顯差異。造模一周后，除空白對照組外，各組大鼠的空腹血糖值無明顯差異。開始灌喂處理3周后，阿卡波糖組、牛蒡根提取物組與模型組開始出現(xiàn)顯著性差異；第 8周后，模型組空腹血糖值為26.4 mmol/L，阿卡波糖組血糖值為19.3 mmol/L，其次為中劑量組22.6 mmol/L、高劑量組20.7 mmol/L及低劑量組21.6 mmol/L。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，牛蒡根提取物BP1具有降低糖尿病鼠空腹血糖的作用。

表3 牛蒡根提取物BP1對糖尿病大鼠體重的影響Table 3 Effects of burdock root extract BP1 on the body weight of diabetic rats (±s , n = 6)

表3 牛蒡根提取物BP1對糖尿病大鼠體重的影響Table 3 Effects of burdock root extract BP1 on the body weight of diabetic rats (±s , n = 6)

注：阿卡波糖組、牛蒡根提取物BP1分別以200 mg/kg、400 mg/kg、600 mg/kg、800 mg/kg三個劑量連續(xù)灌胃8周，空白對照組給予相同量的蒸餾水，對大鼠體重進(jìn)行統(tǒng)計(不同小寫英文字母代表顯著性差異p＜0.05)，下同。

group 0 w 1 w 2 w 4 w 6 w 8 w空白 380.5±37.40a 366.2±33.71a 388.6±38.91b 395.3±40.92b 389.5±45.27b 396.5±47.11ab Control 388.5±30.61a 368.0±30.56a 366.3±39.20c 368.8±43.64c 364.5±40.91c 368.2±42.31c阿卡波糖 388.0±19.20a 366.8±22.16a 421.5±18.36a 422.8±20.34a 420.0±15.62a 393.2±20.60ab 400(低) 395.0±22.32a 368.5±24.22a 413.0±25.44b 424.5±23.36a 425.5±24.81a 402.7±27.91a 600(中) 390.0±32.90a 362.5±31.45a 398.9±33.26b 400.5±32.27ab 385.8±31.90b 382.3±36.22b 800(高) 389.5±16.82a 364.5±20.31a 393.2±22.90b 402.6±15.26ab 395.9±15.58ab 402.1±30.43a

表4 牛蒡根提取物BP1對糖尿病大鼠空腹血糖的影響Table 4 Effects of burdock root extract BP1 on the blood glucose of diabetic rats (±s, n = 6)

表4 牛蒡根提取物BP1對糖尿病大鼠空腹血糖的影響Table 4 Effects of burdock root extract BP1 on the blood glucose of diabetic rats (±s, n = 6)

group 0 w 1 w 2 w 4 w 6 w 8 w空白 6.85±0.42a 6.42±0.42 6.3±0.50 6.5±0.40 6.4±0.40 6.4±0.50 Control 6.8±0.74a 19.8±0.88a 22.9±1.6a 23.8±1.41a 24.7±1.40a 26.4±1.13a阿卡波糖 7.0±0.56a 19.7±1.50a 21.3±2.0b 21.7±1.41c 21.6±1.42bc 19.3±1.05c 400（低） 6.8±0.45a 19.6±1.60a 22.3±1.80a 22.9±1.52b 22.7±1.54b 22.6±1.41b 600（中） 7.0±0.73a 20.1±1.60a 22.5±1.30a 22.7±1.90b 22.6±1.82b 20.7±1.62bc 800（高） 7.0±0.58a 20.0±2.10a 22.3±1.80a 22.9±1.81b 21.9±1.82bc 21.6±1.55bc

2.4 牛蒡根提取物 BP1對糖尿病大鼠血清總膽固醇及甘油三脂的影響

圖1、圖2分別為糖尿病大鼠血清總膽固醇和甘油三酯在灌喂牛蒡根提取物前后的變化情況。在實(shí)驗(yàn)第0周時，除空白對照組，各分組之間無顯著性差異；但實(shí)驗(yàn)第8周后，我們可以看出:模型組TC、TG含量分別高達(dá)1.82 mmol/L，1.57 mmol/L，而阿卡波糖組含量最高達(dá)1.32 mmol/L，1.28 mmol/L；牛蒡根提取物 400組與阿卡波糖組相近為 1.32 mmol/L，1.39 mmol/L；牛蒡根提取物600及800組TC，TG含量分別為1.41 mmol/L、1.48 mmol/L及1.35 mmol/L、1.42 mmol/L。

以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明牛蒡根提取物可以顯著降低血清中TC與TG的含量，具有調(diào)節(jié)血脂的作用。

圖1 牛蒡根提取物BP1對大鼠總膽固醇含量的影響Fig.1 Effects of burdock root extract BP1 on the TG content in rats

圖2 牛蒡根提取物BP1對大鼠甘油三酯含量Fig.2 Effects of burdock root extract BP1 on the TC content in rats

2.5 牛蒡根提取物BP1對糖尿病大鼠SOD及MDA含量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對各組大鼠SOD酶活及MDA含量進(jìn)行統(tǒng)計，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3、圖4。表明牛蒡根提取物組MDA含量與模型組具有顯著性差異（p＜0.05），SOD酶活性高于模型組（p＜0.05）。

圖3 牛蒡根提取物BP1對糖尿病大鼠SOD酶活的影響Fig.3 Effects of burdock root extract BP1 on the SOD enzyme activity of diabetic rats

圖4 牛蒡根提取物BP1對糖尿病大鼠MDA含量的影響Fig.4 Effects of burdock root extract BP1 on the MDA content of diabetic rats

2.6 牛蒡根提取物BP1對糖尿病大鼠IL-18、TNF-α基因表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取腎小球內(nèi)皮細(xì)胞用于RNA的提取并逆轉(zhuǎn)錄；qRT-PCR所用引物見表1。白介素IL-18、腫瘤壞死因子TNF-α均是重要的促炎癥因子。這些促炎癥分子表達(dá)異常增高會促進(jìn)糖尿病腎損害的進(jìn)展。

圖5 牛蒡根提取物BP1對糖尿病大鼠IL-18基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of burdock root extract BP1 on the IL-18expression in rats

圖6 牛蒡根提取物BP1對糖尿病大鼠TNF-α基因表達(dá)的影響Fig.6 Effects of burdock root extract BP1 on the TNF-α expression of diabetic rats

由圖5、圖6可知，通過使用qRT-PCR檢測IL-18、腫瘤壞死因子TNF-α的相對表達(dá)水平，結(jié)果表明了阿卡波糖組與牛蒡根提取物組的 IL-18、腫瘤壞死因子TNF-α的表達(dá)水平明顯下調(diào)。

2.7 牛蒡根提取物 BP1對糖尿病大鼠腎臟器官的影響

圖7 牛蒡根提取物BP1對糖尿病大鼠腎臟器官的影響Fig.7 Effects of burdock root extract BP1 on the kidney organs of diabetic rats

牛蒡根提取物BP1對糖尿病大鼠腎臟器官的影響見圖 7。觀察腎臟的病理組織學(xué)變化：糖尿病模型組大鼠的腎小球基底膜增厚，并出現(xiàn)新月體或者腎小球硬化的病癥，間質(zhì)內(nèi)可見淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤等。阿卡波糖組和牛蒡根提取物組可明顯改善腎小球肥大、系膜擴(kuò)增以及腎纖維化。

2.8 牛蒡根提取物 BP1對糖尿病大鼠胰腺器官的影響

圖8 牛蒡根提取物BP1對糖尿病大鼠腎臟器官的影響Fig.8 Effects of burdock root extract BP1 on the pancreas organs of diabetic rats

觀察胰島的病理組織學(xué)變化：空白組的胰腺組織結(jié)構(gòu)清楚，外分泌部胰腺上皮細(xì)胞與內(nèi)分泌部胰島界限清楚；模型組胰島結(jié)構(gòu)紊亂疏松，形態(tài)不規(guī)則，可見不同程度的萎縮，胰島面積明顯變小且邊緣不整齊，胰島內(nèi)細(xì)胞排列紊亂，數(shù)目明顯減少，部分細(xì)胞胞漿空泡化，部分細(xì)胞核固縮。

阿卡波糖組與牛蒡跟提取物組胰島結(jié)構(gòu)輕度恢復(fù)，萎縮程度好轉(zhuǎn)，邊緣清晰，病變程度較模型組輕，胰島數(shù)目及胰島內(nèi)分泌細(xì)胞數(shù)目均增加。綜上所述，牛蒡根提取物BP1可明顯改善胰腺的病理損傷。

2.9 牛蒡根提取物 BP1對糖尿病大鼠胰島素的影響

圖9 牛蒡根提取物BP1對糖尿病大鼠胰島素的影響Fig.9 Effects of burdock root extract BP1 on the insulin of diabetic rats

通過透射電鏡結(jié)果表明，模型組糖尿病大鼠胰島內(nèi)β細(xì)胞中胰島素分泌顆粒與空白對照組相比明顯減少，牛蒡根提取物BP1 600 mg/kg、牛蒡根提取物BP1 800 mg/kg組及阿卡波糖組均可以顯著增加胰島β細(xì)胞中胰島素分泌顆粒。結(jié)果表明牛蒡根提取物BP1可以在一定程度上改變胰島β細(xì)胞中胰島素分泌顆粒的數(shù)量。

3 結(jié)論

3.1 Rosalia等[28]研究表明，牛蒡子、牛蒡根、牛蒡葉的體積分?jǐn)?shù)70%酒精提取物均具有抗氧化的作用。本文通過檢測糖尿病大鼠血清中MDA及SOD的含量，表明牛蒡根提取物組BP1 MDA含量與模型組具有顯著性差異（p＜0.05），SOD 酶活性高于模型組（p＜0.05）；通過HE染色發(fā)現(xiàn)牛蒡根提取物組腎臟及胰腺組織細(xì)胞形態(tài)要好于模型組，氧化損傷程度比較低，我們分析牛蒡根提取物BP1提高了細(xì)胞抗氧化能力，減少了細(xì)胞的氧化損傷；另外，我們檢測了促炎癥因子IL-18和TNF-α基因表達(dá)情況。qRT-PCR結(jié)果表明阿卡波糖組與牛蒡根提取物組 IL-18、腫瘤壞死因子TNF-α的表達(dá)水平明顯下調(diào)，降低了糖尿病大鼠的腎臟細(xì)胞損傷情況。

3.2 為了研究牛蒡根提取物 BP1對糖尿病的治療作用，本文分別對wistar糖尿病模型大鼠灌喂阿卡波糖200 mg/kg、生理鹽水0.9%、牛蒡根提取物400 mg/kg、600 mg/kg及800 mg/kg處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，牛蒡根提取物組糖尿病大鼠的死亡率顯著低于模型組大鼠（p＜0.05）；灌胃期間，牛蒡根提取物可以在一定程度上對大鼠的體重有維持并恢復(fù)的作用（p＜0.05）；灌胃處理8周后，牛蒡根提取物組對糖尿病大鼠的空腹血糖具有顯著降低的效果（p＜0.05）；同時，我們檢測了牛蒡根提取物對血清甘油三酯及膽固醇是否有降低的作用，結(jié)果表明，牛蒡根提取物BP1可以顯著降低血清中TC與TG的含量，具有調(diào)節(jié)血脂的作用（p＜0.05）；結(jié)果分析表明，牛蒡根提取物BP1提高了細(xì)胞抗氧化能力，減少了細(xì)胞的氧化損傷，抑制促炎癥因子IL-18和TNF-α的表達(dá)，對胰腺和腎臟有一定的保護(hù)作用，并在一定程度上改善了胰島素的分泌情況，從而改善糖尿病鼠的高血糖癥狀，對開發(fā)抗糖尿病的中藥制劑奠定了理論基礎(chǔ)。