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    前列腺癌患者血清miRNA-711水平變化及意義

    2018-07-10 11:22:12張仁忠朱雯銀劉吉文姜睿
    山東醫(yī)藥 2018年22期
    關(guān)鍵詞:管中標(biāo)志物癌癥

    張仁忠,朱雯銀,劉吉文,姜睿

    (1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,四川瀘州 646000;2邛崍市醫(yī)療中心醫(yī)院;3中國人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院)

    前列腺癌(PCa)是發(fā)達(dá)國家男性中最常見的惡性腫瘤之一[1],尋找用于評估PCa的發(fā)展過程且具有診斷特征的指標(biāo)對于PCa有效治療至關(guān)重要。血清前列腺特異抗原(PSA)是PCa臨床篩選和診斷、預(yù)后判斷的重要指標(biāo),但PSA臨床診斷仍具有一定的局限性,如前列腺增生等疾病等均可引起PSA水平升高[2,3]。微小RNA(miRNA)是指約22個(gè)核苷酸長度的小的非編碼RNA,被認(rèn)為是細(xì)胞基因表達(dá)的強(qiáng)大調(diào)節(jié)劑,幾乎參與所有的生命活動過程[4]。同時(shí),miRNA表達(dá)失調(diào)與許多腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展有關(guān),被認(rèn)為是所有癌癥類型中較為有診斷價(jià)值和預(yù)測腫瘤預(yù)后的生物標(biāo)志物[5,6]。miRNA-711是一種抑制腫瘤增殖的新型miRNA[7],其與PCa的關(guān)系尚未見報(bào)道。本研究觀察了PCa患者血清中miRNA-711的水平變化,并探討其意義?,F(xiàn)報(bào)告如下。

    1  資料與方法

    1.1臨床資料選擇2015年1月~2017年5月就診于邛崍市醫(yī)療中心醫(yī)院泌尿外科、中國人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院泌尿外科的PCa患者40例(PCa組),年齡(64.39±7.87)歲。所有患者未接受放化療治療。按照美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)TNM分期標(biāo)準(zhǔn),Ⅰ期14例、Ⅱ期5例、Ⅲ期11例、Ⅳ期10例;按照Gleason分級,8~10分24例、7分7例,2~6分9例。同時(shí)選擇前列腺增生(BPH)患者40例(BPH組)及健康體檢男性對照者40例(對照組),兩組年齡分別為(61.85±5.39)、(57.72±6.20)歲。三組年齡比較具有可比性。本研究對象已簽署知情同意書并通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

    1.2血清miRNA-711檢測方法采用無菌抗凝管收集各組靜脈血標(biāo)本4 mL,提前預(yù)冷離心機(jī)4 ℃下3 000 r/min離心15 min,提取上清液2 mL,再次1 500 r/min離心3 min,提取上清無細(xì)胞液300 μL。用1 mL TRIzol試劑將血清混合,將以上混合液標(biāo)本轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管中,室溫下放置5 min。然后加入等體積的氯仿,加蓋后劇烈搖晃15 s,在室溫下放置5 min,4 ℃下12 000 g離心15 min。將上層水相RNA轉(zhuǎn)移到另一干凈的EP管中,加入0.5 mL異丙醇,室溫靜置10 min,4 ℃下12 000 g離心10 min。離心后看到絮狀膠樣RNA沉淀。RNA洗滌去上清,加入0.6 mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀,4 ℃下7 500 g離心5 min。RNA再溶解去上清,置空氣中5~10 min。用無RNase水重懸RNA沉淀,用槍頭反復(fù)吹打幾次,55~60 ℃靜置10 min。取2 μL儲存液加入另一個(gè)EP管中,再加入98 μL無RNase水,離心混勻,以無RNase水作為空白對照,測OD260/280值。OD260/280值在1.8~2.0可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。血清miRNA-711檢測采用RT-qPCR技術(shù)。采用50 μL體積作為反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)實(shí)驗(yàn),試驗(yàn)體系中包括5×的反應(yīng)緩沖液10 μL,使用2 μg RNA模板、1 μL的RNA酶抑制劑、1 μL的反轉(zhuǎn)錄酶、4 μL的2.5 nmol/L dNTP Mix,加入去RNA酶水定容至50 μL。在美國羅氏公司PCR儀器上設(shè)置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序:42 ℃條件下反應(yīng)60 min,70 ℃條件下反應(yīng)10 min。RT-qPCR反應(yīng)體系包括:Bulge-LoopTMmiRNA RT-qPCR Primer Kit、dNTP mix、Taq酶、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、SYBR Green Ⅰ、去RNA酶水(均購自HaiGene生物試劑公司),反應(yīng)條件:95 ℃ 20 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、70 ℃ 5 s,共40個(gè)循環(huán)。Has-miRNA-711引物序列為:5′-GGGACCCTGG-GAGAGATGTAAG-3′。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔,以U6為內(nèi)參,采用2-ΔCt法計(jì)算miRNA-711水平。

    2 結(jié)果

    2.1各組血清miRNA-711水平比較PCa組、BPH組、對照組血清miRNA-711水平分別為15.65±3.97、19.47±3.51、20.53±4.26,PCa組與BPH組、對照組相比P均<0.05。

    2.2血清miRNA-711水平與PCa臨床病理特征的關(guān)系見表1。

    表1    血清miRNA-711水平與PCa臨床病理特征的關(guān)系

    3 討論

    臨床上,采用PSA診斷PCa會不斷地增加新的PCa病例的數(shù)量,然而關(guān)于篩查PSA是否有效降低PCa的死亡風(fēng)險(xiǎn)尚未達(dá)成共識[8]。由于PSA診斷PCa特異性較低,因此找出檢測PCa的特定分子標(biāo)志物可能是加快PCa診斷、預(yù)后和治療的理性方法。miRNA是一組小的非編碼RNA,通過靶向相應(yīng)的mRNA來轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)[9,10]。許多研究報(bào)道m(xù)iRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān),因而與腫瘤相關(guān)的miRNA標(biāo)志物成為了研究熱點(diǎn)[11]。目前研究表明,大部分miRNA與癌癥有密切的關(guān)系,其中有部分miRNA已被證明在PCa中發(fā)揮重要的作用,并且具有一定的評估預(yù)后的臨床價(jià)值[12~14]。

    目前,關(guān)于miRNA-711的報(bào)道較少。miRNA-711在各種不同的病理組織狀況下可表現(xiàn)為不同的作用,如miRNA-711在乳腺癌和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤中具有致癌性;在胃癌中是一種腫瘤抑制因子[15,16];在HPV陽性宮頸癌細(xì)胞中被鑒定為一種新型miRNA診斷標(biāo)志物[17]。除了癌癥外,miR-711在外傷性腦損傷、心肌梗死和胰島素抵抗中均具有重要的作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn),PCa組血清中miRNA-711水平低于BPH組、對照組,Ⅲ、Ⅳ期的PCa患者血清miRNA-711水平比Ⅰ、Ⅱ期者低,Gleason病理評分>7分的PCa患者血清miRNA-711水平比≤7分者低,提示miRNA-711可能參與了腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、增殖、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。通過本次研究,我們發(fā)現(xiàn)miRNA-711是PCa中一種新型的miRNA,可作為PCa分級、預(yù)后評估的監(jiān)測因子和潛在治療靶點(diǎn),同時(shí)通過檢測血清中的miRNA-711水平能有助于提高PCa早期的輔助診斷率。

    綜上可見,PCa患者血清miRNA-711水平降低,miRNA-711可能作為抑癌因子參與了PCa的發(fā)生與發(fā)展過程,可能是PCa診斷、預(yù)后評估的新型生物標(biāo)志物,但其對PCa具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

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