牛卵泡CMKLR1基因CDS區(qū)克隆及結(jié)構(gòu)分析

郝慶玲，朱芷葳，許冬梅，李鵬飛

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

CMKLR1(Chemokine-like receptor 1)為趨化因子樣受體1，在人類研究中也稱ChemR23，屬于分泌型蛋白[1]。CMKLR1在動(dòng)物體內(nèi)廣泛表達(dá)，尤其在心肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞、脂肪細(xì)胞中顯著高表達(dá)[2]。Arita等研究發(fā)現(xiàn)，CMKLR1在具有免疫及造血功能的組織中廣泛表達(dá)，如骨髓、脾臟、胎兒肝臟、淋巴結(jié)、胸腺和闌尾等[3]。1996年Owman等從人B淋巴母細(xì)胞cDNA文庫中鑒定出一段與G蛋白偶聯(lián)受體家族(G-protein coupled receptor, GPCRs)高度同源的cDNA序列，將其命名為CMKLR1，后來研究證實(shí)為Chemerin脂肪因子的天然受體[4]。

目前，對(duì)CMKLR1生物學(xué)功能的研究主要有以下幾方面：(1)參與免疫與炎性反應(yīng)[5～7]。當(dāng)動(dòng)物機(jī)體出現(xiàn)炎性反應(yīng)時(shí)，巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞發(fā)揮其抗原遞呈作用，向炎性反應(yīng)部位集合，通過CMKLR1與其配體Chemerin相互作用，誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣離子釋放和磷酸化，同時(shí)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK1/2 通過結(jié)合Gi-偶聯(lián)的異源三聚體來抑制cAMP的累積，從而完成對(duì)炎性部位的免疫反應(yīng)。目前認(rèn)為，肥胖屬于慢性低水平的炎性狀態(tài)，可引起脂肪組織炎性反應(yīng)。Cash等通過研究小鼠脂肪細(xì)胞的抗炎特性發(fā)現(xiàn)，其抗炎機(jī)理可能是Chemerin通過募集表達(dá)有CMKLR1的巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞聚集，從而激活免疫細(xì)胞發(fā)揮抗炎特性[8]；(2)調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化[9]。Goralski等通過對(duì)沙鼠的研究發(fā)現(xiàn)，在沙鼠脂肪細(xì)胞分化的早期階段和脂肪細(xì)胞成熟時(shí)，CMKLR1表達(dá)顯著增加；通過基因沉默技術(shù)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CMKLR1在脂肪細(xì)胞分化早期(前3 d)具有重要作用，但在第4天將CMKLR1基因沉默，則對(duì)脂肪細(xì)胞分化和脂肪細(xì)胞表型無明顯影響；(3)參與胰島素抵抗[10]。Takahashi等通過培養(yǎng)小鼠3T3-L1細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，CMKLR1與其配體Chemerin相互作用，可顯著增加胰島素刺激引起的葡萄糖攝入，并能提高ISR-1(胰島素受體底物-1)酪氨酸的磷酸化水平，增強(qiáng)胰島素刺激信號(hào)。

課題組前期對(duì)牛卵泡顆粒細(xì)胞(Granulosa cells, GCs)轉(zhuǎn)錄組測序研究發(fā)現(xiàn)，CMKLR1 mRNA在從屬卵泡表達(dá)量極顯著高于優(yōu)勢(shì)卵泡，提示CMKLR1對(duì)牛卵泡發(fā)育具有重要調(diào)控作用[11]。因此，本研究選取牛卵泡作為研究對(duì)象，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增并克隆牛CMKLR1全CDS區(qū)，對(duì)其編碼的蛋白序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析，為后期深入研究CMKLR1對(duì)牛卵泡發(fā)育的影響奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料

本試驗(yàn)材料來源于山西省文水縣肉牛屠宰場，選擇海福特母牛，屠宰后采集雙側(cè)均正常發(fā)育卵巢，投入DPBS中帶回實(shí)驗(yàn)室，修剪卵泡并分離GCs，-80 ℃保存。

試驗(yàn)中用到的試劑主要包括：Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker 2000、Tap DNA 聚合酶、dNTP、瓊脂糖(均購自TAKARA)。

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1顆粒細(xì)胞分離

選擇直徑>5 mm的卵泡，在盛有DPBS的平皿中從中線剪開，小心刮取卵泡內(nèi)細(xì)胞并丟棄卵泡膜性組織，將平皿內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)移至離心管，4 ℃-Z1 400 r·min-1離心5 min，棄上清即為GCs。

1.2.2引物的設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank提供的牛CMKLR1 mRNA(NM_001145235.1)核酸序列，Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，交由TAKARA公司合成，引物序列如下：

上游：5'-ATGGAGGCTGAGGATTACAACGCCTC-3'

下游：5'-TCAGAGCATGCCAGTCTCCCTC-TCGT-3'

1.2.3總RNA抽提與RT-PCR

Trizol法提取GCs總RNA，經(jīng)核酸測定儀檢測合格后，對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系10 μL：5×Prime Script TM Buffer 2 μL，Prime Script TMRT Enzyme Mix1 0.5 μL，Oligo dT Primer 25 pmol，隨機(jī)引物50 pmol，Total RNA 1 μL，DEPC定容至10 μL，混勻后置于PCR儀，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.2.4全CDS區(qū)擴(kuò)增

擴(kuò)增體系為：10×PCR buffer 2.5 μL， dNTP 2 μL，上下游特異性PCR引物各0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄cDNA 2 μL，Taq聚合酶0.25 μL，ddH2O加至25 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，58.7 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1%凝膠電泳檢測后膠回收試盒回收純化PCR產(chǎn)物，送交TAKARA公司測序。

1.3　生物信息學(xué)分析

測序結(jié)果CDS區(qū)分析應(yīng)用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)；NCBI在線BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)對(duì)24種動(dòng)物CMKLR1氨基酸序列比對(duì)分析；在線軟件NetOGlyc4.0(www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)、NetNGlyc1.0(www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)和NetPhos 3.1(www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對(duì)CMKLR1一級(jí)結(jié)構(gòu)O-糖基化、N-糖基化和磷酸化位點(diǎn)分別分析；3D結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域用 Conserved Domain Search Services (CD Search) (www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) 分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　RT-PCR分析

總RNA提取后，經(jīng)核酸檢測儀檢測，RNA濃度和純度均符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，凝膠電泳檢測可見條帶大小為1 100 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。

2.2　牛卵泡CMKLR1序列分析

測序結(jié)果顯示，牛卵泡CMKLR1基因CDS區(qū)全長1 089 bp，編碼362個(gè)氨基酸；HMMTOP v2.0分析表明，CMKLR1蛋白序列中存在7個(gè)跨膜區(qū)段(圖2中下劃線部分)，分別位于36～60、73～96、111～130、151～172、220～239、256～276和291～315區(qū)段，符合GPCRs的結(jié)構(gòu)特征。

圖1　目的片段RT-PCR電泳圖Fig.1　Electrophoresis pattern of RT-PCR product注: M: DNA Marker; T: 目的產(chǎn)物Note: M: DNA Marker; T: Target product

圖2　CMKLR1序列分析Fig.2　CMKLR1 sequence analysis注: *:終止子; 下劃線: 跨膜區(qū)段Note: *:Terminator; Underscore: Transmembrane section.

2.3　CMKLR1多序列比對(duì)及聚類分析

將牛卵泡CMKLR1全CDS區(qū)序列翻譯為氨基酸序列，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫搜索獲得其它24種動(dòng)物對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，BLAST分析軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，該序列與北美野牛序列相似性最高(99.4%)，與其它動(dòng)物序列相似性為80.0%～96.7%，表明CMKLR1在物種進(jìn)化過程中保守性較強(qiáng)(圖3)。

圖3　多物種氨基酸序列比對(duì)Fig.3　Multi-species amino acid sequence alignment.

基于不同動(dòng)物(包括偶蹄類、長鼻類、鯨類、靈長類、食肉類和嚙齒類)CMKLR1氨基酸序列聚類分析，應(yīng)用遺傳距離鄰近法系統(tǒng)發(fā)育分析(圖4)表明，牛(Bostaurus)與北美野牛(Bisonbison)遺傳距離最近，與馬島刺猬(Echinopstelfairi)遺傳距離最遠(yuǎn)。

圖4　CMKLR1氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.4　Phylogenetic tree based on amino acid sequences of CMKLR1

2.4　牛CMKLR1糖基化和磷酸化位點(diǎn)分析

NetOGlyc 4.0軟件分析表明CMKLR1有4個(gè)O-糖基化位點(diǎn)(評(píng)分閾值>0.5)，分別為第195位、第196位、第209位和第344位(表1)。

NetNGlyc 1.0分析表明，CMKLR1不存在信號(hào)肽，沒有暴露N-糖基化位點(diǎn)的機(jī)制存在。預(yù)測結(jié)果僅提示在第7位可能是潛在的N-糖基化位點(diǎn)(評(píng)分閾值>0.5)，第187位評(píng)分值較低，形成N-糖基化的可能性較小(表2)。

NetPhos 3.1分析表明：CMKLR1氨基酸序列從6～353位共有50個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)(圖5，評(píng)分閾值>0.5)，磷酸化位點(diǎn)的激酶種類包括unsp, EGFR, CKII, CKI, DNAPK, p38MAPK, PKC, PKA, cdc2和CaM-II共10種。大量位點(diǎn)的存在和激酶的多樣性也表明了CMKLR1功能調(diào)節(jié)的復(fù)雜性。

表1　CMKLR1 O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測Table 1　Predicted O-glycosylation of CMKLR1

表2　CMKLR1 N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測Table 2　Predicted N-glycosylation of CMKLR1

圖5　CMKLR1磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig.5　Predicted phosphorylation of CMKLR1

2.5　牛CMKLR1三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

由PDB數(shù)據(jù)庫和CDD數(shù)據(jù)庫預(yù)測CMKLR1三級(jí)結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域(圖6)，結(jié)果顯示：氨基酸序列36～315之間共形成7個(gè)平行排列的螺旋結(jié)構(gòu)(圖6 A)，并7次橫跨胞膜；功能域分析也進(jìn)一步表明7次跨膜結(jié)構(gòu)(7tm)對(duì)CMKLR1功能的決定作用，屬于典型的GPCRs(圖6B)。

圖6　CMKLR1立體結(jié)構(gòu)和功能域預(yù)測Fig.6　Predicted 3D structure and functional domains of CMKLR1

3　討論與結(jié)論

蛋白質(zhì)糖基化修飾過程對(duì)蛋白翻譯、降解、免疫保護(hù)以及信號(hào)調(diào)控等功能執(zhí)行具有重要意義，如大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子和酶類物質(zhì)均存在翻譯后糖基化修飾[12]；而磷酸化修飾過程對(duì)蛋白質(zhì)調(diào)控細(xì)胞增殖、發(fā)育、分化以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動(dòng)有關(guān)鍵作用，如CDKs(Ser/Thr激酶)通過激活周期蛋白并形成復(fù)合物，參與細(xì)胞周期調(diào)控[13]，細(xì)胞內(nèi)NADPH 氧化酶和電子傳遞鏈相關(guān)蛋白均存在磷酸化調(diào)控過程[14]。氨基酸序列結(jié)構(gòu)分析表明，CMKLR1分子中存在4個(gè)O-糖基化位點(diǎn)、1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和50個(gè)磷酸化位點(diǎn)。大量翻譯后修飾位點(diǎn)的存在，保證了CMKLR1在不同器官、組織和細(xì)胞中執(zhí)行生物功能時(shí)，通過精確的調(diào)控發(fā)揮其多樣化功能。

三級(jí)結(jié)構(gòu)和功能域預(yù)測分析結(jié)果表明，CMKLR1蛋白分子具有典型的G蛋白偶聯(lián)受體家族7次跨膜(7tm)結(jié)構(gòu)存在。該結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)是空間結(jié)構(gòu)中均有7個(gè)跨膜α螺旋，并將蛋白分割為膜內(nèi)C端、膜外N端、3個(gè)膜內(nèi)Loop環(huán)和3個(gè)膜外Loop環(huán)，且C端和膜內(nèi)Loop環(huán)上均有鳥苷酸環(huán)化酶結(jié)合位點(diǎn)[15]。人類β2腎上腺素能受體結(jié)構(gòu)是第一個(gè)被揭示的GPCR，并于2011年對(duì)其晶體結(jié)構(gòu)成功解析[16，17]。由于GPCRs立體結(jié)構(gòu)在胞膜內(nèi)外都有Loop環(huán)存在，使得其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性較差。GPCRs結(jié)構(gòu)解析對(duì)應(yīng)用研究意義重大，GPCRs作為藥物靶點(diǎn)設(shè)計(jì)具有廣泛的應(yīng)用前景[18]。

CMKLR1作為GPCRs，對(duì)蛋白激活和炎性部位趨藥性調(diào)節(jié)具有重要作用[19]。體外試驗(yàn)和動(dòng)物在體試驗(yàn)表明，CMKLR1通過信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)局部炎癥或組織損傷部位細(xì)胞CMKLR1的過表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用[19，20]。研究表明，CMKLR1對(duì)人和大鼠生殖功能具有調(diào)控作用[21，22]；動(dòng)物卵泡的生長和分化依賴于促性腺激素、細(xì)胞因子和生長因子嚴(yán)格調(diào)控以及卵泡GCs、膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間的相互調(diào)節(jié)[23]；反之，卵泡細(xì)胞之間的相互作用對(duì)卵泡的形成和類固醇激素的分泌至關(guān)重要[24～26]。Wang等研究表明，長期對(duì)老鼠模型雄激素刺激，卵巢和循環(huán)系統(tǒng)的趨化素水平顯著升高，卵泡高水平的CMKLR1會(huì)抑制FSH誘導(dǎo)的GCs類固醇激素生成[27]。然而，不同發(fā)育階段牛卵泡CMKLR1的表達(dá)模式及其對(duì)卵泡發(fā)育的調(diào)控機(jī)理仍不清楚，本研究對(duì)牛卵泡CMKLR1結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測，為后期深入研究CMKLR1調(diào)控牛卵泡發(fā)育奠定了基礎(chǔ)。