生防菌玫煙色棒束孢IF-1106對梨小食心蟲殺蟲活性的測定

韓志慧，邢培翔，刁紅亮，胡軍，田晶，馬瑞燕*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，山西 太谷 030801；3.呂梁學院 生命科學系，山西 離石 033000)

梨小食心蟲Grapholithamolesta(Busck)，簡稱“梨小”，屬鱗翅目(Lepidoptera)，卷蛾科(Tortricidae)，是世界性的主要蛀果類害蟲之一[1]。梨小食心蟲寄主植物包括薔薇科的多種果樹[2,3]，如桃、梨、蘋果、李、杏、海棠、楊梅、山楂、枇杷等。該蟲具有個體小、危害隱蔽、棲境多樣、世代重疊、轉(zhuǎn)寄主危害等特點，因此其預測、預報和防治較為困難[4,5]。

果園防治梨小食心蟲的主要措施是噴灑化學殺蟲劑和果實套袋[6]。過量施用化學農(nóng)藥污染環(huán)境，極易產(chǎn)生抗藥性,危及食品安全，而果樹套袋人工成本巨大，影響果業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展。隨著人們環(huán)保和食品安全意識的提高，生物防治逐漸引起人們的關注，如天敵防治[7]、性信息素防治[8]、病原微生物防治等，其中病原微生物防治害蟲具有持效期長、安全高效、不傷害天敵、不易產(chǎn)生抗性等特點，可以有效地克服化學農(nóng)藥防治帶來的不良后果[9]。目前，應用病原微生物對梨小食心蟲進行防治的報道不多，能見到的主要是蘇云金桿菌(Bt)和白僵菌[10]。

玫煙色棒束孢(Isariafumosorosea)，屬于半知菌亞門(Deuteromycotian)絲孢綱(Hyphomycetes)絲孢目(Moniliales)叢梗孢科(Moniliaceae)棒束孢屬(Isaria)，是一種重要的昆蟲病原真菌。玫煙色棒束孢寄主范圍廣，包括同翅目、鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目等8目[11]，能侵染煙粉虱[12]、桃蚜[13]、小菜蛾[14]、菜青蟲[15]、柑橘木虱[16]等40多種昆蟲，是生物防治重要的殺蟲真菌之一。山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院生物安全與生物防治研究組篩選出1株潛力生防菌株，保藏登記名稱為玫煙色棒束孢IF-1106。前期研究表明，該菌株對煙粉虱和桃蚜具有較高致病力。經(jīng)孢子懸浮液(1×107孢子·mL-1)處理的煙粉虱2齡若蟲7 d后累計校正死亡率達83.05%[12]；經(jīng)高濃度孢子懸浮液(1×108孢子·mL-1)處理桃蚜后累計死亡率達91.7%[13]。

本研究在室內(nèi)條件下測定了玫煙色棒束孢IF-1106菌株對梨小食心蟲的毒力，目的在于考察該菌株作為梨小食心蟲生防活性物的潛力，為其防治梨小食心蟲的應用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

1.1.1供試蟲源

梨小食心蟲來自于山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院生物安全與生物防治研究組繼代培養(yǎng)的梨小食心蟲種群[17]。

1.1.2供試菌株

玫煙色棒束孢IsariafumosoroseaIF-1106菌株，保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3供試菌株孢子懸浮液的制備

玫煙色棒束孢IF-1106菌株試管斜面保存于4 ℃冰箱中。將玫煙色棒束孢轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，在(25±0.5)℃恒溫條件下培養(yǎng)10 d。在無菌條件下，用0.1%吐溫-80溶液洗脫孢子，將懸浮液在磁懸浮攪拌器上搖動30 min將成鏈的孢子打散，用4層醫(yī)用紗布過濾除去菌絲，血球計數(shù)板估計分生孢子濃度并稀釋至所需倍數(shù)。

1.2　試驗方法

1.2.1對梨小卵的殺卵活性測試

試驗方法以劉麗娟研究白僵菌對淡色庫蚊卵的致病力測定[18]的方法為基礎，參考《農(nóng)藥生物活性測試標準操作規(guī)范——SOP-SC-2063鱗翅目殺卵測定》并作適當修改，具體方法為：取剛孵化(放置在(26±0.8)℃、相對濕度為70%～80%、光周期為L∶D=15∶9 的培養(yǎng)箱中)24 h后的卵，將卵浸漬于孢子懸浮液中，1 s后取出保濕培養(yǎng)。每次處理20粒卵，6次重復，以0.1%吐溫-80水溶液進行空白對照處理。

1.2.2對梨小幼蟲的殺蟲活性測試

試驗方法以雷研園研究白僵菌對小菜蛾的致病力測定[19]的方法為基礎，參考《農(nóng)藥生物活性測試標準操作規(guī)范——SOP-SC-2049鱗翅目幼蟲噴霧法》，并作適當修改。具體方法為：在培養(yǎng)皿底部鋪一張濾紙，取大小基本相同健康的梨小食心蟲3齡幼蟲，將幼蟲放在濾紙上，取2 mL孢子懸浮液用喉頭噴霧器噴霧，加入人工飼料，保濕飼養(yǎng)。每次處理15頭幼蟲，6次重復，并以0.1%吐溫-80水溶液進行空白對照處理。

1.2.3對梨小蛹的殺蛹活性測試

試驗方法參考徐玲研究蟲生真菌對黃粉蛹的毒力測定[20]，并作適當修改。具體方法為：取剛化蛹(放置在(26±0.8)℃、相對濕度為70%～80%、光周期為L∶D=15∶9 的培養(yǎng)箱中)24 h后的蛹，將蛹浸漬于孢子懸浮液中，1 s后取出，在無菌濾紙片上吸干表面水分后放置在含無菌濾紙片的平皿內(nèi)，保濕培養(yǎng)。每次處理15粒蛹，6次重復，并以0.1%吐溫-80水溶液進行空白對照處理。

1.2.4對梨小成蟲的殺蟲活性測試

試驗方法以袁盛勇球孢白僵菌對南瓜實蠅致病力測定[21]，參考《農(nóng)藥生物活性測試標準操作規(guī)范——SOP-SC-2044玻璃容器藥膜法》方法，并作適當修改，具體為：使用試管作為藥膜容器，在試管口均勻粘取藥液并旋轉(zhuǎn)形成均勻藥液膜，稍微干燥后用該試管轉(zhuǎn)移梨小食心蟲成蟲(使其在試管口沾上藥液)至250 mL燒杯中(燒杯底部以潤濕濾紙平鋪，以保持容器內(nèi)部濕度)，達到數(shù)量后以雙層紗布封口，置于培養(yǎng)箱中。每次處理15頭成蟲，6次重復，并以0.1%吐溫-80水溶液進行空白對照處理。

1.3　數(shù)據(jù)處理

根據(jù)生物測定數(shù)據(jù)，分別計算不同處理蟲態(tài)的死亡(侵染)率，并以Abbott公式進行校正，即：

死亡率/%=處理死亡幼蟲數(shù)×100/處理總蟲數(shù)

(1)

孵化抑制率/%=處理亂未孵化數(shù)×100/處理總卵數(shù)

(2)

校正死亡率/%=(處理組死亡率-對照組死亡率)×100/(100-對照組死亡率)

(3)

校正孵化抑制率/%=(處理組孵化抑制率-對照組孵化抑制率)×100/(100-處理組孵化抑制率)

(4)

蛹校正羽化抑制率的計算公式與卵校正孵化抑制率相同。采用Origin軟件繪制不同蟲態(tài)的累計校正死亡率曲線圖，并采用DPS軟件進行統(tǒng)計分析。

2　結果與分析

2.1　玫煙色棒束孢對梨小食心蟲卵的致病力

不同濃度孢子懸浮液(1×106、1×107、1×108孢子·mL-1)對梨小食心蟲卵的校正抑制孵化率見圖1。試驗結果表明：玫煙色棒束孢IF1106孢子懸浮液對梨小食心蟲卵的孵化有一定的影響，其中高濃度的孢子懸浮液對梨小食心蟲卵孵化的抑制作用更強。隨著孢子懸浮液濃度的升高對梨小食心蟲卵孵化的抑制作用也逐漸增強(卵從接種后第3天開始孵化，故本試驗記錄第3～7天的孵化數(shù)據(jù))。經(jīng)高濃度孢子懸浮液(1×108孢子·mL-1)處理后校正孵化抑制率為79.61%，表現(xiàn)出較高的致病作用(表1)。被侵染的梨小食心蟲卵先逐漸長出白色菌絲，后逐漸被玫煙色狀菌絲完全覆蓋(圖2)，不再孵化。

2.2　玫煙色棒束孢對梨小食心蟲幼蟲的致病力

圖1　不同濃度IF-1106孢子懸浮液處理梨小食心蟲卵的校正孵化抑制率Fig.1　The corrected hatching inhibition rate of G. molesta of the egg treated with different concentrations of IF-1106 spore suspension

不同濃度孢子懸浮液(1×106、1×107、1×108孢子·mL-1)對梨小食心蟲幼蟲的校正死亡率見圖3。試驗結果表明：玫煙色棒束孢IF-1106孢子懸浮液對梨小食心蟲幼蟲具有一定的致病力。隨著孢子懸浮液濃度的升高，幼蟲死亡率由35.75%增加到58.89%。孢子懸浮液濃度為1×108孢子·mL-1時，致病作用最強，為58.89%。被侵染的幼蟲長出白色菌絲，蟲體僵硬。

表1不同濃度孢子懸浮液對個梨小食心蟲累計校正死亡(抑制)率對比/%

Table1Comparison of the cumulative corrected mortality (inhibition) rates of different concentrations of spore suspensions againstG.molesta

蟲態(tài)Stage玫煙色棒束孢IF-106不同濃度孢子懸浮液/孢子·mL-1I. fumosorosea IF-1106 different concentrations of spore suspension1×1061×1071×108卵24.55C63.66B79.61A幼蟲36.26C52.22B58.89A蛹8.05C70.12B100.00A成蟲42.49A45.56A48.89A

注:同行不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Different letters within the same column are significantly different according to Tukey’s HSD(P<0.05).

圖2　玫煙色棒束孢IF-1106侵染卵的外部癥狀Fig.2　External symptoms of I. fumosorosea IF-1106 infected egg

圖3　不同濃度IF-1106孢子懸浮液處理梨小食心蟲幼蟲的累計校正死亡率Fig.3　Cumulative corrected mortality rate of G. molesta of larvae treated with different concentrations of IF-1106 spore suspension

2.3　玫煙色棒束孢對梨小食心蟲蛹的致病力

不同濃度孢子懸浮液(1×106、1×107、1×108孢子·mL-1)對梨小食心蟲蛹的校正羽化抑制率見圖4。試驗結果表明：玫煙色棒束孢IF-1106孢子懸浮液對梨小食心蟲蛹具有一定的致病力，其中高濃度的孢子懸浮液對梨小食心蟲蛹羽化的抑制作用更強。隨著孢子懸浮液濃度的升高對梨小食心蟲蛹羽化的抑制作用也逐漸增強。隨著孢子懸浮液濃度升高，對蛹羽化的抑制作用也逐漸增強，經(jīng)高濃度孢子懸浮液(1×108孢子·mL-1)處理后校正羽化抑制率為100%，表現(xiàn)出極高的致病作用。被感染的梨小食心蟲蛹表面先長出白色菌絲，后逐漸被玫煙色狀菌絲完全覆蓋(圖5)，不再羽化。

圖4　不同濃度IF-1106孢子懸浮液處理梨小食心蟲蛹的校正羽化抑制率Fig.4　Corrected eclosion inhibition rate of G. molesta of pupae treated with different concentrations of IF-1106 spore suspension

圖5　玫煙色棒束孢IF-1106侵染蛹的外部癥狀Fig.5　External symptoms of I. fumosorosea IF-1106 infected pupa

2.4　玫煙色棒束孢對梨小食心蟲成蟲的致病力

不同濃度孢子懸浮液(1×106、1×107、1×108孢子·mL-1)對梨小食心蟲成蟲的校正死亡率見圖6。試驗結果表明：玫煙色棒束孢IF-1106孢子懸浮液對梨小食心蟲成蟲具有一定的致病力。隨著孢子懸浮液濃度增加，梨小食心蟲成蟲的累計校正死亡率由42.49%增加到48.89%，致病作用逐漸增強。孢子懸浮液濃度為1×108孢子·mL-1時，對成蟲致病作用最強，為48.89%。被侵染的成蟲，蟲體保濕培養(yǎng)后體表有玫煙色狀菌絲長出。

玫煙色棒束孢IF-1106孢子懸浮液對梨小食心蟲各蟲態(tài)都具有一定的毒力，隨著孢子懸浮液濃度的升高毒力逐漸增強。梨小食心蟲的卵和蛹對玫煙色棒束孢的敏感性較高，經(jīng)高濃度(1.0×108孢子·mL-1)孢子懸浮液處理后，卵的孵化抑制率為79.61%，LC50值為6.10×106孢子·mL-1(表2)；蛹的羽化抑制率為100%，LC50值為1.15×107孢子·mL-1。梨小食心蟲幼蟲和成蟲對玫煙色棒束孢的敏感性較低，經(jīng)高濃度(1.0×108孢子·mL-1)孢子懸浮液處理后，幼蟲的死亡率為58.89%，成蟲的死亡率為48.89%。玫煙色棒束孢IF-1106對梨小食心蟲的致病力表現(xiàn)為蛹>卵>幼蟲>成蟲，表明該菌株對梨小食心蟲蛹和卵具有較高防效，而對幼蟲和成蟲的防效較差。

圖6　不同濃度IF-1106孢子懸浮液處理梨小食心蟲成蟲的累計校正死亡率Fig.6　Cumulative corrected mortality rate of G. molesta of adult treated with different concentrations of IF-1106 spore suspension

表2對梨小食心蟲不同蟲態(tài)的毒力測定結果
Table2The results of the virulence test on different insect states ofG.molesta

蟲態(tài)Stage毒力回歸方程Toxicity regression equationLC50/孢子·mL-1LC50LC50 95%置信限/孢子·mL-1LC50 (95% confidence limit)相關系數(shù)Correlation coefficient卵y=0.144 9+0.758 2x6.10×1062.71×106～1.38×1070.978 0幼蟲y=2.899 7+0.298 1x2.72×107—0.978 1蛹y=8.879 5+2.074 3x1.15×1071.81×106～9.03×1060.986 8成蟲y=4.325 0+0.080 8x2.27×1081.96×108～2.64×1080.999 8

3　討論與結論

通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)玫煙色棒束孢的分生孢子在昆蟲表皮附著，孢子出現(xiàn)突起，分生孢子萌發(fā)形成芽管和附著胞，并緊緊附著于寄主表皮生長[22]。高濃度的孢子提高了單位昆蟲體表玫煙色棒束孢的孢子數(shù)，增加了孢子侵染體表形成附著胞的幾率[23]，增強了玫煙色棒束孢的致病力。劉麗娟研究了球孢白僵菌對淡色庫蚊的致病力，結果表明隨孢子懸浮液濃度的增加菌株對淡色庫蚊卵的孵化抑制逐漸明顯[18]；袁盛勇研究球孢白僵菌對扶桑綿粉蚧成蟲的致病力結果表明經(jīng)高濃度(2.0×108個·mL-1)孢子懸浮液處理后，成蟲的累計校正死亡率最高[24]。這些研究與本試驗的結果相一致，即高濃度的生防菌孢子對于成功寄主至關重要。

不同蟲態(tài)對生防菌的敏感度差異較大。高濃度的玫煙色棒束孢孢子對蛹的致病力為100%，這可能與蛹的表面物質(zhì)有關，這種物質(zhì)有利于真菌入侵，其侵染機制還有待研究。高濃度的玫煙色棒束孢孢子懸浮液對成蟲的致病力為48.89%，防治效果較差，因為高齡的幼蟲和成蟲的表面有一層蠟質(zhì)，對分生孢子的侵入有一定的阻礙作用[25]。

利用昆蟲病原真菌防治梨小食心蟲不僅可以降低果實農(nóng)藥殘留量，而且更有利于維持生態(tài)平衡，保護天敵[26]。曹仲采用白僵菌(1.75 kg·hm-2)和對硫磺做膠露劑(0.2 kg·hm-2)混合液，防治枇杷園梨小食心蟲取得了較好的效果[27]。梨小食心蟲越冬幼蟲多在樹基翹皮內(nèi)越冬，經(jīng)過白僵菌懸液對樹基的處理，結果表明用白僵菌防治梨小食心蟲越冬幼蟲有一定效果[28]。陳斌等人的研究結果表明球孢白僵菌菌株在室內(nèi)25 ℃條件下對西花薊馬成蟲具有較高的毒力，但在自然條件下，感染球孢白僵菌的西花薊馬罹病蟲體很少[29]。因此，使用玫煙色棒束孢防治梨小食心蟲時，應注意玫煙色棒束孢與殺蟲劑、殺菌劑的混配使用，使“以菌治蟲”的生物防治技術與其他害蟲防治方法協(xié)調(diào)使用；若在其越冬代羽化期間，使用玫煙色棒束孢防治梨小食心蟲，可以起到降低越冬蟲源的作用。此外，蟲生真菌在果園自然流行，可以對果園整個季節(jié)起到生態(tài)調(diào)控作用，在測報蛹期高峰期助增精準釋放，效果更加。本試驗是在室內(nèi)條件下進行的，分生孢子與蟲體充分接觸，而田間實際的溫、濕度均在變化，所以玫煙色棒束孢對梨小食心蟲防治效果如何，需進一步試驗驗證。

梨小食心蟲的卵和蛹對玫煙色棒束孢的敏感性較高，經(jīng)高濃度(1.0×108孢子·mL-1)孢子懸浮液處理后，卵的孵化抑制率為79.61%，LC50值為6.10×106孢子·mL-1；蛹的羽化抑制率為100%，LC50值為1.15×107孢子·mL-1。梨小食心蟲幼蟲和成蟲對玫煙色棒束孢的敏感性較低，經(jīng)高濃度(1.0×108孢子·mL-1)孢子懸浮液處理后，幼蟲的死亡率為58.89%，成蟲的死亡率為48.89%。本試驗表明，玫煙色棒束孢IF-1106菌株可作為防治梨小食心蟲的潛力菌株。